Của axit amin

Một phần của tài liệu Nghiên cứu xác định hàm lượng các axit amin trong một số loài nấm lớn ở vùng bắc trung bộ bằng phương pháp sắc ký lỏng h (Trang 48 - 62)

Hình 2.7: Mẫu nấm 608 Hình 2.8: Mẫu nấm 619 Hình 2.9: Mẫu nấm 621

Hình 2.10: Mẫu nấm HKG 401 Hình 2.11: Mẫu nấm HKG 406

2.3.2. Xử lí mẫu

2.3.2.1. Đối với quy trình phân tích axit amin thủy phân

Chuẩn bị mẫu nấm đã được đồng nhất, xay nhỏ cho vào lọ đựng.

Cân chính xác 1g nấm bằng cân phân tích chính xác 0,0001 cho vào ống chịu nhiệt. Cho 3 ml dung dịch HCl 6M vào ống đựng mẫu lắc đều và làm hòa tan mẫu bằng cách đặt ống vào máy siêu âm trong vòng 10 phút, loại bỏ không khí trong vòng 15 phút. Thủy phân mẫu bằng cách cho vào tủ sấy và đặt nhiệt độ tủ sấy ở 1250C trong 24h. Lấy mẫu ra khỏi tủ sấy để nguội, điều chỉnh về pH = 5÷6 bằng Na2B4O7 0,25M. Lọc qua giấy lọc thường và định mức vào bình 50ml với nước cất đề ion. Điều chỉnh về pH = 9÷10 bằng

Na2B4O7 0,25M. Lọc qua màng lọc 0,45 µm, cho mẫu vào vial tiến hành chạy trên máy HPLC.

Quá trình chẩn bị mẫu được tóm tắt bằng sơ đồ sau:

Hình 2.12: Quy trình phân tích axit amin thủy phân

Cân 1g mẫu

Ống nghiệm 3ml HCl 6M

Đánh siêu âm mẫu 10 phút

Loại bỏ không khí bằng máy hút chân không

Thủy phân mẫu ở nhiệt độ 1250C và thời gian 24h tợp

Để nguội, mở ống nghiệm, điều chỉnh về pH = 5 – 6 bằng Na2B4O7 0,25M

Định mức vào bình 50ml Lọc qua giấy lọc

Điều chỉnh về pH =9 ÷10 bằng Na2B4O7 0,25M

Chạy mẫu trên hệ thống HPLC

Lấy mẫu ra khỏi tủ sấy

2.3.2.2. Đối với quy trình phân tích axit amin tự do

Chuẩn bị mẫu nấm đã được đồng nhất, xay nhỏ cho vào lọ đựng.

Cân chính xác 1g nấm bằng cân phân tích chính xác 0,0001. Cho vào bình định mức 10ml, định mức đến vạch bằng nước cất 2 lần. Sau đó tiến hành siêu âm trong 15 phút, cho vào ống ly tâm dung tích 10ml, tiến hành li tâm trong 30 phút với tốc độ 5000 vòng/phút. Lọc mẫu qua giấy lọc, chỉnh về pH = 9÷10 bằng Na2B4O7 0,25M. Lọc qua màng lọc 0,45µm cho mẫu vào vial tiến hành chạy trên máy HPLC.

Tóm tắt quá trình chuẩn bị và xử lí mẫu bằng sơ đồ sau:

Hình 2.13: Quy trình phân tích axit amin tự do

Cân 1g mẫu

Cho vào bình định mức 10ml và định mức tới vạch Siêu âm 15 phút

Cho vào ống li tâm và tiến hành li tâm trong 30 phút với tốc độ 5000 vòng/phút

Lọc mẫu

Chỉnh pH=9-10 bằng Na2B4O7 0,25M Lọc qua màng lọc 0,45 μm Chạy mẫu trên hệ thống HPLC

2.3.3. Tiến hành phân tích trên máy

−Cột sắc ký: cột C18 150 × 4,6mm, kích thước hạt 5μm.

−Nhiệt độ cột: 400C.

−Tốc độ dòng: 0,45ml/phút.

−Pha động: Pha động A: hỗn hợp dung môi nước và tetrahydrofuran; Pha động B: hỗn hợp dung môi nước, axetonitril và methanol theo gradient:

TT Time (min) A % B % Flow (ml/min)

1 0 100 0 0,45 2 18 0 100 0,45 3 18,1 0 100 0,45 4 18,5 0 100 0,8 5 23,9 0 100 0,8 6 24 0 100 0,45 7 25 100 0 0,45

- Chương trình bơm mẫu:

TT Chương trình

1 Hút 5 μl từ vial 10 - Đệm borate 2 Hút 1 μl từ vial 11 - Dẫn suất OPA 3 Hút 0 μl từ vial 12 - Nước

4 Hút 1 μl từ vial chứa mẫu

5 Hút 0 μl từ vial 11 - Nước 6 Trộn mẫu 7 Hút 1 μl từ vial 14 – FMOC 8 Hút 0 μl từ vial 12 - Nước 9 Trộn mẫu 10 Bơm mẫu

- Huỳnh quang bước sóng kích thích λ = 340nm, bước sóng phát xạ λ = 450 nm [28].

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu xử lý mẫu tối ưu

3.1.1. Khảo sát nồng độ HCl

Để chọn nồng độ axit HCl phù hợp cho sự thủy phân mẫu chúng tôi khảo sát một dãy mẫu thực (mẫu nấm 01) cùng với chuẩn axit amin 10pmol được thêm vào và thủy phân trong môi trường HCl ở các nồng độ: 5M; 5,5M; 6M; 6,5M. Ở nhiệt độ thủy phân 1250C trong thời gian 24h. Kết quả thực nghiệm cho thấy nồng độ HCl ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu suất thủy phân. Khi nồng độ HCl thấp, mẫu thủy phân không hoàn toàn, hiệu suất thấp, còn khi nồng độ HCl đủ lớn mẫu thủy phân hoàn toàn.

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi

TT Nồng độ HCl

Axit amin

Nồng độ (pmol) Cs+mẫu - Cmẫu Cos

(pmol) H% Cs+mẫu Cmẫu 1 5 Asp 63,699 52,284 11,415 10 114,15 5,5 Asp 27,502 19,744 7,758 10 77,58 6 Asp 39,465 29,741 9,724 10 97,24 6,5 Asp 40,729 31,057 9,672 10 96,72 2 5 Ser 28,940 24,229 4,712 10 47,12 5,5 Ser 17,966 11,135 6,831 10 68,31 6 Ser 27,432 17,864 9,568 10 95,68 6,5 Ser 25,794 16,387 9,407 10 94,07 3 5 Gly 66,221 54,316 11,905 10 119,05 5,5 Gly 37,371 28,154 9,217 10 92,17 6 Gly 49,686 39,943 9,743 10 97,43 6,5 Gly 49,356 39,574 9,782 10 97,82 4 5 Arg 101,279 94,478 6,801 10 68,01 5,5 Arg 18,831 12,892 5,939 10 59,39 6 Arg 29,931 21,072 9,543 10 95,43 6,5 Arg 29,668 20,541 9,126 10 91,26

Trong đó: Cos là nồng độ chuẩn thêm vào (pmol) Cs+mẫu là nồng độ mẫu thêm chuẩn (pmol) Cmẫu là nồng độ mẫu phân tích (pmol)

Hình 3.1: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào nồng độ HCl

Từ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi các axit amin vào nồng độ HCl thủy phân cho thấy khi nồng độ HCl chưa đủ để thủy phân mẫu thì các axit amin chưa tách khỏi nhau dẫn đến hiệu suất thu hồi của một số axit amin lớn hơn 100% (do lẫn tạp chất và các pic khác chưa tách). Còn các axit amin đã tách được thì hiệu suất thu hồi cũng thấp có thể do lẫn tạp chất hoặc chưa tách được hoàn toàn. Từ nồng độ 6-6,5M thì hiệu suất thu hồi ổn định và các hiệu suất thu được đều lớn hơn 90%. Từ kết quả này chúng tôi chọn nồng độ axit HCl 6M làm môi trường thủy phân mẫu cho các nghiên cứu tiếp theo.

Hình 3.2: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01 tại nồng độ HCl 5M

Hình 3.3: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01 tại nồng độ HCl 5,5M

Hình 3.4: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01 tại nồng độ HCl 6M

Hình 3.5: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01 tại nồng độ HCl 6,5M

3.1.2. Khảo sát thời gian thủy phân mẫu

Để chọn thời gian phù hợp cho sự thủy phân các axit amin, chúng tôi chuẩn bị mẫu nấm 01 và mẫu nấm 01 thêm chuẩn 10pmol tiến hành thủy phân trong môi trường HCl 6M, nhiệt độ 1250C và thủy phân tại các mốc thời gian

khác nhau: 16h, 18h, 20h, 22h, 24h và 26h.

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi các axit amin

TT Thời gian Axit amin Nồng độ (pmol) Cs+mẫu - Cmẫu Cos (pmol) H% Cs+mẫu Cmẫu 1 16 Glu 68,986 57,765 11,221 10 112,21 18 Glu 69,426 58,936 10,490 10 104,90 20 Glu 53,164 44,340 8,824 10 88,24 22 Glu 33,746 24,285 9,461 10 94,61 24 Glu 22,723 13,096 9,627 10 96,27 26 Glu 19,413 10,103 9,310 10 93,10 2 16 His 91,261 85,024 6,237 10 62,37 18 His 92,347 85,443 6,904 10 69,04 20 His 77,453 68,227 9,227 10 92,27 22 His 54,209 44,678 9,531 10 95,31 24 His 40,042 30,340 9,703 10 97,03 26 His 40,938 31,514 9,424 10 94,24 3 16 Thr 32,294 26,656 5,638 10 56,38 18 Thr 31,430 26,311 5,119 10 51,19 20 Thr 28,804 20,099 8,705 10 87,05 22 Thr 21,329 11,683 9,645 10 96,45 24 Thr 20,630 10,820 9,809 10 98,09 26 Thr 23,267 14,053 9,214 10 92,14 4 16 Ala 112,788 101,857 10,931 10 109,31 18 Ala 110,736 100,112 10,624 10 106,24 20 Ala 84,125 74,667 9,458 10 94,58 22 Ala 37,816 28,191 9,625 10 96,25 24 Ala 28,097 18,504 9,593 10 95,93 26 Ala 30,423 21,542 8,881 10 88,81

Hình 3.6: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi các axit amin vào thời gian thủy phân

Kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.6 cho thấy dưới 20h mẫu chưa được thủy phân hoàn toàn, các axit amin chưa tách hết khỏi tạp chất nên cho hiệu suất thu hồi không ổn định. Khi thời gian thủy phân lớn hơn 20h đủ để tách được các axit amin ra khỏi nền mẫu nên hiệu suất thu hồi bắt đầu ổn định. Thời gian từ 22h-24h cho hiệu suất thu hồi tốt nhất, đều lớn hơn 90%, ở 24h cho hiệu suất rất lớn (> 95%). Vậy nên chúng tôi chọn 24h là thời gian thủy phân mẫu phân tích.

Từ các kết quả thu được khi khảo sát nồng độ axit HCl và thời gian thủy phân đã trình bày ở trên chúng tôi đề xuất quy trình phân tích cho axit amin thủy phân ở mục 2.3.2.1. Đối với axit amin tự do không qua thủy phân nên dùng quy trình phân tích ở mục 2.3.2.2.

Hình 3.7: Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01 tại thời gian thủy phân 16h

Hình 3.8: Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01 tại thời gian thủy phân 18h

Hình 3.9 : Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01 tại thời gian thủy phân 20h

Hình 3.10: Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01 tại thời gian thủy phân 24h

3.2. Đánh giá phương pháp

3.2.1. Xây dựng các phương trình đường chuẩn và xác định khoảng tuyến tính

Để tiến hành xây dựng đường chuẩn chúng tôi chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ: 10pmol, 25pmol, 100pmol để xác định khoảng tuyến tính của 17 axit amin. Kết quả đo được như sau (bảng 3.3):

Bảng 3.3: Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ (pmol/µl) của axit amin

TT Axit amin Nồng độ Diện tích Nồng độ Diện tích Nồng độ Diện tích 1 Asp 10 781,812 25 1755,649 100 5438,597 2 His 10 658,736 25 1587,502 100 6239,592 3 Thr 10 1015,310 25 2341,675 100 8992,931 4 Tyr 10 958,267 25 2197,594 100 8405,716 5 Ile 10 945,163 25 2259,511 100 8830,265 6 Glu 10 963,071 25 2094,327 100 6318,022 7 Ser 10 1172,479 25 2403,424 100 8491,895 8 Gly 10 1037,715 25 2380,595 100 8435,319 9 Ala 10 1062,448 25 2284,784 100 8007,862 10 Arg 10 1299,576 25 2771,053 100 8919,414 11 Cys-ss- cys 10 440,336 25 845,849 100 2293,169 12 Val 10 1208,736 25 2715,620 100 8757,126 13 Met 10 1292,891 25 3019,753 100 9728,984 14 Phe 10 1000,467 25 2283,057 100 5793,015 15 Leu 10 1293,723 25 2712,360 100 9084,671 16 Lys 10 499,848 25 811,406 100 3801,906 17 Pro 10 1636,646 25 2116,079 100 7006,031

pic sắc ký vào nồng độ axit amin ta có đường chuẩn của Aspartic như sau:

Hình 3.11: Đường chuẩn định lượng Asp

Phương trình hồi quy tuyến tính của Asp: y = 50,892x + 268,560 Hệ số tương quan: R2 = 0,9991

(x là nồng độ, y là diện tích pic, hệ số góc là 50,892) Tương tự, ta có đường chuẩn định lượng của 16 axit amin khác

Một phần của tài liệu Nghiên cứu xác định hàm lượng các axit amin trong một số loài nấm lớn ở vùng bắc trung bộ bằng phương pháp sắc ký lỏng h (Trang 48 - 62)

Tải bản đầy đủ (DOC)

(99 trang)
w