I.2.3.1 Tác dụng làm bền thành mạch
Trong y học, Vit.P có tác dụng làm bền thành mạch. Người ta đã phát hiện ra rằng Vit.P là tập hợp của nhiều loại sắc tố thực vật gốc Flavonoid. Đại diện điển hình là Catechin và Leucoanthoxyan rồi đến Flavonol, Flavanon và một số
Chalcon…
Những Flavonoid trên có tác dụng làm tăng sức bền và tính đàn hồi của thành mao mạch chủ yếu do khả năng điều hòa, làm giảm sức thấm vào mao mạch, ngăn cản không cho protit của máu thẩm dịch qua các mô khác, có tác dụng dự phòng vỡ
mao mạch, gây xuất huyết, phù thũng.
Flavonoid thường song song tồn tại cùng Vit.C trong tự nhiên. Trong cơ thể
người và động vật, hai chất này có tác dụng hỗ trợ lẫn nhau nên thường được phối hợp trong điều trị dự phòng và chữa các bệnh chảy máu cấp, các bệnh gây tổn thương sức bền của mao mạch (ban xuất huyết, xung huyết võng mạc, huyết áp cao, thương hàn…), các bệnh gây tăng sự thẩm thấu của mao mạch (phù nề, thủy thũng…), chữa các bệnh hoại huyết.
I.2.3.2 Tác dụng chống oxy hóa
Trong cơ thể bình thuờng, các gốc superoxide O2- được sinh ra trong quá trình hô hấp tế bào chuyển thành nước theo phản ứng với xúc tác là enzym superoxide dismutaza, catalaza hay glutathione peroxydaza. Từ gốc superoxide ban đầu sẽ sinh ra hàng loạt gốc: 1O2, OH-, ...và các gốc tự do khác. Các gốc này được gọi là các dạng oxy hoạt động, chúng kém bền và có khả năng phản ứng rất lớn.
Phản ứng của gốc tự do là nguyên nhân sinh ra quá trình peroxy hóa các chất hữu cơ. Các gốc OH và oxy đơn bội 1O2 thường là tác nhân khơi mào phản ứng. Tiếp đó các gốc thứ cấp phản ứng với các phân tử mới khác tạo ra phản ứng dây chuyền, cứ thế nhân mãi cho tới khi tiêu tốn hết cơ chất (không có enzym tham gia nữa). Quá trình này gây nên sự phá hoại nghiêm trọng các tổ chức trong cơ thể, gây nên những biến đổi như ung thư, hoại tử, rối loạn tiêu hóa… Đến giai đoạn dập tắt mạch, các gốc phản ứng với nhau tạo ra những sản phẩm bền, không gốc. Hậu quả
của quá trình là sự polymer hóa. Ở người già các tổ chức bị xơ chai hóa, không mềm mại vì phản ứng gốc tự do đã làm cho các gốc liên hợp lại với nhau.
Như vậy các phân tử sinh học đã bị biến đổi mạnh, những protein bất thường xuất hiện trong cơ thể. Sự tăng số lượng các gốc tự do hoạt động là nguyên nhân phát sinh nhiều bệnh nguy hiểm và sự lão hóa cơ thể.
Ngoài các gốc tự do phát sinh trong quá trình sinh lý bình thường, cơ thể còn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài: tia phóng xạ, tia cực tím, thuốc trừ sâu, các chất nitro hữu cơ, hydrocacbon đa vòng, …
Như vậy các gốc tự do hoạt động, kém bền vững luôn được sinh ra tong tế bào hủy hoại dần cơ thể sống. Để chống lại tác hại đó, mỗi cơ thể cần có những hệ
thống các chất chống oxy hóa nội sinh, ngoài ra còn có những chất Antioxidant khác được đưa vào cơ thể theo con đường thức ăn nước uống. Ngày nay, người ta cho rằng Flavonoid là chất Antioxidant lý tưởng đối với con người.
• Khả năng triệt tiêu các gốc tự do của Flavonoid
và tồn tại ở các dạng hydroquinone, semiquinon, quinon. Những Flavonoid có các nhóm hydroxyl ở vị trí octo dễ dàng bị oxy hóa dưới tác dụng của các enzyme polyphenoloxydaza và peroxydaza có trong tế bào động thực vật. Phản ứng như sau:
Polyphenoloxydaza
O2 + Flavonoid (khử) ---→ Flavonoid(oxy hóa) (Hydroquinone) (semiquinon hoặc quinon)
Peroxydaza
H2O2 + Flavonoid (khử) ---→ Flavonoid (oxy hóa) (Hydroquinone) (semiquinon hoặc quinon)
Semiquion hoặc quinon là những gốc tự do hoạt động có thể nhận được điện tử và hydro từ những chất cho khác để trở lại hydroquinone.
Khi đưa Flavonoid vào cơ thể sẽ sinh ra các gốc tự do bền vững hơn các gốc tự do được hình thành trong quá trình bệnh lý (viêm nhiễm, ung thư, lão hóa…), chúng có khả năng giải tỏa các điện tử trên mạch vòng của nhân thơm và hệ nối đôi liên hợp, làm triệt tiêu các gốc tự do hoạt động. Các gốc tự do tạo nên bởi Flavonoid do bền vững hơn nên chúng không tham gia vào dây chuyền phản ứng oxy hóa tiếp theo, do vậy cắt đứt dây chuyền phản ứng oxy hóa.
Ngoài cơ chế trên, Flavonoid còn kìm hãm sự phát sinh các gốc tự do hoạt
động do có khả năng tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp để chúng không xúc tác cho phản ứng sinh ra các gốc tự do hoạt động như OH, 1O2.
Các Flavonoid hấp thụ ánh sáng ở vùng 300 – 400 nm có hoạt tính như chất lọc ánh sáng bên trong, bảo vệ lục lạp và các cơ quan khác của cây khỏi sự phá hủy của tia cực tím.
I.2.3.3 Tác dụng của Flavonoid đối với enzyme
Các công trình nghiên cứu ảnh hưởng của Flavonoid đối với các enzym động vật cho biết chúng có tác dụng ức chế nhiều enzyme như: protein tyrosin kinaza,
protein kinaza, hualuromidaza, kìm hãm không đặc hiệu peroxydaza, lipooxygenaza, oxydoreductaza… Bên cạnh tác dụng kìm hãm, nhiều Flavonoid có khả năng làm tăng hoạt tính enzyme prolin hydroxydaza, là một enzym quan trọng trong quá trình làm lành vết thương và tạo sẹo.
Bản thân các chất Flavonoid khi ở trong cơ thể động vật có thể tồn tại ở dạng oxy hóa hoặc khử và chịu nhiều biến đổi phức tạp khác nhau cho nên có thể trong các điều kiện khác nhau nó sẽ thể hiện hoạt tính sinh học khác nhau: kìm hãm hoặc kích thích hoạt động của enzyme, hoặc kích thích có mức độ có điều kiện.
Tác dụng Flavonoid lên các enzym sinh học là cơ sở sinh hóa để định hướng cho việc sử dụng các chất Flavonoid thiên nhiên vào lĩnh vực sinh y học, phục vụ
sức khỏe và đời sống con người.
I.2.3.4 Tác dụng kháng sinh của Flavonoid
Tác dụng chống viêm nhiễm và kháng khuẩn của Flavonoid đã được nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới chứng minh. 24 anthoxyanin, leucoanthoxyanin và axit phenolic có tác dụng kìm hãm Salmonella. Hầu hết các chất này đều có khả
năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucoza.
Tác dụng chống giun của Flavonoid đã được thống kê với 16 chalcon và những chất tương tự. Chalcon nói chung có hiệu quả này đặc biệt là các Chalcon có vài nhóm thế OH.
Tác dụng kháng virus của Flavonoid cũng đã được khẳng định. Khả năng ức chế virus HIV ở các tế bào H9 của 35 Flavonoid chiết xuất từ thực vật và tổng hợp
đã thấy rằng các hợp chất có nối đôi ở vị trí C-2,C-3 và chứa nhóm OH ở C-5, C-7 thể hiện hoạt tính cao hơn. Sự có mặt của các nhóm thế hydroxyl hoặc halogen ở
vòng B thường làm giảm hoạt tính. Khi thêm quercetin vào virut gây bệnh ở người, virus sẽ bị kìm hãm nếu nó có vỏ bọc và chết nếu không có vỏ bọc.
- Flavonoid ức chế enzyme transpeptidaza làm cho mucopeptid - yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được.
- Gắn lên màng bào tương của vi khuẩn, làm thay đổi tính thẩm chọn lọc của màng tương. Vì vậy làm một số chất cần thiết cho đời sống vi khuẩn như nucleotit, pyrimidin, purin lọt qua màng bào tương ra ngoài.
- Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn theo 2 kiểu: phong bế
mạch peptit của vi khuẩn bằng cách phong bế enzyme transferaza chuyển axit amin từ ARN vào mạch làm mạch không kéo dài thêm được hoặc tạo ra protein bất thường vô dụng đối với đời sống của vi khuẩn làm chúng không sử dụng được.
- Ức chế tổng hợp axit nucleic
- Flavonoid có thể tác động vào ADN khuôn, ức chế tổng hợp ARN của vi khuẩn
I.2.3.5 Tác dụng chống ung thư
Một số Flavonoid hoặc Polyphenol có tác dụng kìm hãm sự phát triển của khối u. Trong số 55 Flavonoid được nghiên cứu thì 15 chất trong số đó có tác dụng gây độc thế bào với tối thiểu là 1 trong 5 dòng ung thư nghiên cứu. Các hợp chất 2’- benzyloxy-5methoxyflavon, 2’-benzyloxy-5,7-dimethoxyflavon…thể hiện tính gây
độc tế bào với dòng tế bào LI210 và HL-60. Các Flavonoid có oxy ở vị trí 7,8 và 4’, 2’ thể hiện tác dụng chống khối u.
I.2.3.6 Một sốứng dụng của Bioflavonoid trong Y học
Củng cố và làm giảm tính thấm thành mạch máu và tế bào nên được sử dụng trong những trường hợp chảy máu và nguy cơ chảy máu như cao huyết áp, bảo vệ
mao mạch khỏi bị histamin làm tổn thương, làm tăng sự hồi phục các mao mạch đã bị tia tử ngoại làm tổn thương.
Có khả năng chống viêm loét do các nguyên nhân nội sinh hoặc ngoại sinh, kháng nhiều loại vi khuẩn và nấm khó tiêu diệt, chống dịứng.
Tác dụng tốt trong các bệnh gan mật: ngăn chặn các quá trình hủy hoại cấu trúc và chức năng gan trong nhiều trạng thái bệnh lý, làm tăng nhanh quá trình tái sinh và hồi phục chức năng của tế bào gan.
Điều hòa hàm lượng cholesterol trong máu, tránh nguy cơ xơ vữa mạch, phục hồi trương lực cơ tim, điều hòa nhịp tim và huyết áp, điều hòa chuyển hóa canxi.
Ảnh hưởng lên hệ thống nội tiết nên có vai trò đáng kể trong việc điều hòa cân bằng sinh học cơ thể.
Về phương diện miễn dịch học, có nhiều Bioflavonoid có khả năng kích thích limpho bào sản xuất interferon, ức chế hiện tượng degramilation, ức chế sự nhân lên của virus.
Giảm đau do tác dụng chống co thắt.
Một số Flavonoid có tác dụng chống khối u lành và ác tính. Tính chất này phụ
thuộc vào sự có mặt của hệ nối đôi liên hợp trong phân tử và vị trí các nhóm thế.
Làm tăng tạo máu do làm tăng tổng hợp axit folic của vi khuẩn đường ruột, tăng số lượng hồng cầu và tỷ lệ hemoglobin.
Chương II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
II.1. Mẫu thực vật.
Cây Lá móng tay (Lawsonia inermis L.) được thu hái vào tháng 01 năm 2010 tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc. Mẫu cây được TS. Ninh Khắc Bản, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định.
II.2. Phản ứng định tính [10].
Sử dụng các phản ứng hóa học đặc trưng để phát hiện các lớp chất trong các phần chiết. Thửđịnh tính Flavonoid:
- Phản ứng với NaOH: Lấy vào ống nghiệm một lượng dung dịch etanol – nước cặn chiết, thêm vào đó vài giọt dung dịch NaOH, nếu dung dịch chuyển sang màu vàng thì cặn đó có Flavonoid
- Phản ứng Shinoda: Lấy một lượng dung dịch etanol – nước cặn chiết, thêm vào đó một mảnh kẽm đã đánh sạch. Nhỏ từ từ dung dịch HCl đặc vào, nếu dung dịch chuyển sang màu cam, hồng hoặc đỏ thì cặn đó có Flavonoid
- Phản ứng với FeCl3/Etanol: Hòa tan cặn trong metanol, dùng capilla chấm dung dịch này lên giấy lọc hoặc bản mỏng sau đó phun hoặc nhúng FeCl3/Etanol. Nếu xuất hiện màu xanh đến xanh đen thì cặn đó có Flavonoid.
II.3. Các phương pháp sắc ký [4,8,10,16] II.3.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC).
Phương pháp sắc ký lớp mỏng là một phương pháp hiện đang được sử dụng rất rộng rãi trong các ngành khoa học hóa học – sinh học – hóa dược với các mục
đích khác nhau: để tách hỗn hợp các cấu tử vô cơ hoặc hữu cơ với độ nhạy cao (có thể phát hiện các chất vi lượng với độ tin cậy cao), lượng mẫu phân tích nhỏ ( chỉ
cần dùng ống capilla chấm vài giọt dung dịch vào bản mỏng), tốc độ phân tích nhanh, cần thời gian ngắn thậm chí có thể phân tích nhiều mẫu cùng lúc, kĩ thuật tiến hành đơn giản, rẻ tiền. Phương pháp sắc ký lớp mỏng có thểđược dùng để phân tích định tính hay định lượng, hoặc để kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất cũng như hỗ trợ cho các phương pháp sắc ký khác (sắc ký cột) để tìm hệ dung môi phù hợp cho phân tách bằng sắc ký.
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18F254s (Merck) để khảo sát sơ bộ cặn chiết. Sử dụng các hệ
dung môi khác nhau để khảo sát và chọn ra một hệ tách tốt nhất.
Phát hiện vệt chất trên bản mỏng:
- Bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm
- Dùng thuốc thử là: H2SO4 10%, vanilin/H2SO4 được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ cho đến khi hiện màu.
II.3.2. Sắc kí lớp mỏng điều chế.
Sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 F254 (Merck, kí hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4
10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silicagel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp.
II.3.3. Sắc ký cột (CC).
Sau khi khảo sát bằng bản mỏng, tiến hành sắc ký cột để tách một số hợp chất trong phần chiết.
Sắc ký cột thường: cột là một ống thủy tinh hình trụ, phía dưới có khóa, chất hấp phụ là Silicagel pha thường và pha đảo. Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040- 0,063 mm (240-430 mesh). Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 µm, Fujisilisa Chemical Ltd.). Việc rửa giải được thực hiện dưới áp suất thường. Đây là một
phương pháp cổ điển được sử dụng nhiều nhưng thời gian phân tích lâu, hiệu suất tách không cao.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Quá trình sắc ký cũng được thực hiện trong một ống thủy tinh hình trụ, chỉ khác là dung môi đi từ trên xuống dưới tác dụng của máy bơm (có áp suất), vì vậy tốc độ dung môi đi vào đều, thời gian phân tích nhanh, hiệu quả tách tốt hơn.
II.4. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất. [4,8,16,36]
Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các phương pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà sử dụng phương pháp phổ cụ thể, cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác hoá học của hợp chất phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, tiến hành sắc ký so sánh.
II.4.1. Điểm nóng chảy (Mp).
Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hoá sinh biển, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
II.4.2. Phổ khối lượng (ESI-MS).
Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization mass spectra)
được đo trên máy AGILENT 1200 LC-MSD Trap của Viện Hoá sinh biển, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
II.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hoá học (chemical shift). Ngoài ra,
đặc trưng của phân tử còn được xác định nhờ vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
-Phổ 1H - NMR: Trong phổ này, độ chuyển dịch hoá học (δ) của các proton
được xác định trong thang ppm từ 0 - 14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của
độ chuyển dịch hoá học và tương tác spin mà xác định cấu trúc phân tử của hợp