Sản xuất giấm ăn: Trong lên men acetic, cơ chất chủ yếu là ethanol với nồng độ trên dưới 10% trong môi trường. Có 2 phương pháp lên men acid acetic:
-Phương pháp nhanh (còn gọi là phương pháp Đức): hiện nay được sử dụng để sản xuất giấm ăn trên thế giới. Giống được sử dụng là Acetobacter schiitzenbachii và
Acetobacter curvum. Với phương pháp này người ta có thể lên men các thùng gỗ tới
-Phương pháp chậm (còn gọi là phương pháp Orlean hoặc phương pháp Pháp): giống ở đây được sử dụng là Acetobacter orleaneuse. Phương pháp này hiệu suất thấp nhưng thích hợp cho công việc làm giấm ở gia đình hoặc sản xuất ở quy mô nhỏ.
Ngoài ra còn phương pháp lên men chìm với chủng vi khẩn Acetobacter suboxydans (Lương Đức Phẩm, 1998).
Sản xuất thạch dừa: thạch dừa là món ăn thú vị dùng để tráng miệng và được dùng chung với sirô thêm hương. Thạch dừa được tạo thành bởi sự lên men của vi khuẩn Acetobacter xylinum trong môi trường nước dừa già và nước cốt dừa loại béo. Khi vi khuẩn Acetobacter xylinum sống trong môi trường nước dừa thì glucose sẽ kết hợp với acid béo để tạo thành một chất mầm ở màng tế bào cùng với enzyme. Enzyme này có thể polymer hóa glucose thành cellulose.
Sản xuất vitamin C: Trong sản xuất vitamin C cần nguyên liệu đầu là L- sorbose. Muốn có sorbose cần phải chuyển hóa từ D-sorbit là một sản phẩm hóa học được biến đổi từ glucose, sự chuyển hóa socbit thành sorbose phải nhờ vi khuẩn
Acetobacter suboxydans với enzyme xúc tác là sorbit-dehydrogenase. Quá trình chuyển hóa kéo dài 1-3 ngày và có thể bổ sung sorbit một lần nữa để tổng nồng độ đạt tới 30%. Hiệu suất chuyển hóa sorbit thành sorbose có thể đạt tới 90% (Lương Đức Phẩm, 1998).
Một số ứng dụng khác: Màng BC (Bacteria cellulose) thu nhận bằng phương pháp lên men bề mặt sau 1 ngày. Sau khi xử lý màng thực phẩm BC đạt giá trị cảm quan, có độ chịu lực cao và không bị biến tính khi xử lý nhiệt. Sử dụng màng BC làm màng bao xúc xích được đánh giá tốt. Dùng BC làm màng bảo quản dừa tươi giữ nguyên chất lượng sau 2 tuần bảo quản ở nhiệt độ phòng và 4 tuần bảo quản ở nhiệt độ mát.
Sử dụng màng BC hấp phụ Bacterionic 200 AU/mL có thể bảo quản 3 ngày thịt tươi sơ chế tối thiểu ở nhiệt độ mát. Sản phẩm sữa chua uống với nồng độ bột BC 0,5% đạt chất lượng về chỉ tiêu cảm quan, không tách lớp, dung dịch đồng nhất trong thời gian bảo quản ( Tạp chí Công Nghệ Sinh Học, số 1/08).
Ngoài ra vi khuẩn Acetobacter còn được ứng dụng trong sản xuất nước giải khát, bánh mì đen,… (Bùi Thị Quỳnh Hoa và Nguyễn Bảo Lộc, 2008).
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Thời gian và địa điểm
Thời gian: từ 06/2014 đến 11/2014
Địa điểm: Phòng Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Nguyên liệu
Quả, hạt lên men, hoa, lá ca cao được thu thập ở Cần Thơ và Bến Tre (Bảng 5). Cho mẫu vào từng túi chứa mẫu riêng biệt và trữ lạnh.
Bảng 4. Nguồn nguyên liệu và địa điểm thu mẫu
Địa điểm Mẫu Trạng thái mẫu
Xã An Khánh, huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre Hoa Tươi Lá
Hạt lên men đã phơi khô
Hạt lên men 1 ngày Khô Hạt lên men 2 ngày
Ướt Hạt lên men 3 ngày
Hạt lên men 4 ngày
Huyện Phong Điền, thành phố Cần Thơ
Hoa
Tươi Lá
Vỏ
Hạt lên men đã phơi khô Khô Hạt lên men 3 ngày
Ướt Hạt lên men 4 ngày
Hạt lên men 6 ngày
3.1.3. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất
a. Thiết bị - dụng cụ
Các thiết bị và dụng cụ thuộc phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm. Máy đo OD (Hitachi, Nhật), máy lắc ủ Eppendorf (Đức), lò vi sóng (Sanyo, Hàn Quốc), máy ly tâm lạnh (Hettich, Đức), tủ lạnh để trữ mẫu (Sanyo, Nhật), tủ ủ vi sinh
trùng nhiệt ướt (Pbi- international, Đức), bộ micropipette P10, P20, P100, P1000 (Bio- Rad, USA), pH kế (Schott, Đức), máy vortex (Đức).
Ngoài ra còn có các dụng cụ khác như: đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh (Merck), eppendorf,...
b. Hóa chất
Môi trường YPGD: 5% yeast extract, 5% polypeptone, 5% glycerol, 5% D- glucose.
Các hóa chất khác: agar, CaCO3, ethanol, acid acetic, bromocresol green, cồn tuyệt đối, phenoltalein, NaOH,…
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phân lập các chủng vi khuẩn acid acetic
Mục đích: Phân lập các chủng AAB thuần từ quả, hạt lên men, hoa, lá của ca
cao.
Phương pháp thực hiện
Thu các mẫu ca cao ở Cần Thơ và Bến Tre. Chuẩn bị môi trường YPGD và
YPGD agar được khử trùng ở 121oC trong 20 phút và được bổ sung 4% ethanol trước
khi sử dụng.
+ Môi trường YPGD: cho 50 mL môi trường vào bình tam giác. + Môi trường YPGD agar: rót vào đĩa petri (15-20 mL/đĩa).
Cân 5 g mẫu cho vào bình tam giác có sẵn 50 mL môi trường vô trùng. Ủ ở
30oC trong 1-2 ngày.
Cấy trải trên môi trường YPGD có bổ sung 4% ethanol, 2% agar và 0,5%
CaCO3.
Lựa chọn các khuẩn lạc tạo vòng halo trên môi trường là AAB. Khuẩn lạc vi khuẩn acid acetic sẽ tạo vòng sáng xung quanh do vi khuẩn này tạo ra acid acetic hòa
tan CaCO3 làm mất màu trắng đục của CaCO3.
Tiếp tục cấy phân lập nhiều lần để thu được chủng thuần. Quan sát dưới kính hiển vi để xác định độ đồng nhất của tế bào vi khuẩn, chụp hình để lưu trữ.
3.2.2. Xác định hình thái, sinh lý, sinh hóa các chủng vi khuẩn acid acetic
Nhuộm Gram, thử catalase và oxydase.
Phân loại các chủng AAB thuộc hai giống Acetobacter và Gluconobacter bằng phản ứng oxy hóa acetic tạo CO2 và H2O (Watchara et al., 2009). Cấy các chủng AAB trên môi trường YPGD bổ sung bromocresol green 0,02% ủ ở 30oC trong 24-72 giờ cho tới khi không có sự thay đổi màu sắc. Được đánh giá như sau:
Sau 24 giờ tất cả các chủng đều chuyển môi trường từ xanh lam sang vàng.
Sau 48-72 giờ, đối với giống Gluconobacter môi trường vẫn giữ màu vàng,
giống Acetobacter làm môi trường chuyển từ màu vàng thành màu xanh lục. Chú ý
một số chủng mạnh có thể làm mất màu môi trường.
3.2.3. Sơ tuyển các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid acetic
Mục đích: Sơ tuyển các chủng vi khuẩn có khả năng lên men acid acetic dựa trên
khả năng oxy hoá acetate trên môi trường có chỉ thị bromocresol green.
Phương pháp tiến hành
Nuôi các chủng AAB trong ống nghiệm chứa môi trường YPGD trong 24 giờ. Nhỏ một giọt dung dịch nuôi cấy lên giữa đĩa môi trường thạch màu xanh chứa bromocresol green ethanol agar (ethanol 0,2%, yeast extract 0,3%, bromocresol green 0,01%) đã chuẩn bị và ủ ở 30oC.
Đo và so sánh vòng màu vàng sinh ra xung quanh AAB sau 24 và 48 giờ.
Các nghiệm thức được thực hiện 3 lần để lấy giá trị trung bình. Các chủng có khả năng sinh acid mạnh sẽ được lựa chọn để thử khả năng chịu nhiệt.
3.2.4. Khảo sát khả năng phát triển ở các nồng độ acid acetic khác nhau
Mục đích: Khảo sát khả năng chịu acid acetic của các chủng AAB đã phân lập Phương pháp thực hiện
Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa petri với 3 lần lặp lại.
Cấy các chủng AAB đã được phân lập và tuyển chọn lên đĩa chứa môi trường YPGD (2% agar) bổ sung acid acetic ở các nồng độ ban đầu khác nhau: 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5% và 3,0%.
Ủ ở 30oC. Theo dõi và đánh giá khả năng phát triển trên đĩa sau 48-72 giờ.
Phương pháp thực hiện
Cấy các chủng AAB vừa tuyển chọn vào môi trường YPGD chứa 4% ethanol. Ủ ở các nhiệt độ khác nhau: 30oC, 37oC, 39oC, 41oC, 43oC và 45oC.
Theo dõi sự phát triển của AAB sau 2 và 3 ngày. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
3.2.6. Tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt có khả năng sinh acid mạnh acid mạnh
Mục đích: Tuyển chọn các chủng AAB lên men mạnh có khả năng phát triển ở
nhiệt độ cao.
Phương pháp thực hiện
Nuôi các chủng AAB trong ống nghiệm chứa 5 mL môi trường YPGD có bổ sung 10% dịch trích khoai tây trong 24 giờ, lắc 150 vòng/phút ở 30oC.
Rút 1 mL từ dịch lỏng vừa ủ vào 100 mL môi trường YPGD lỏng có bổ sung 4% ethanol.
Ủ ở 30oC, 37oC, 38oC và 39oC và lắc ở 150 vòng/phút (do vi khuẩn có khả năng chịu được nhiệt độ cao nhưng khả năng sinh acid kém hoặc không thể sinh acid nên tiến hành ủ ở nhiệt độ tối đa khoảng 39oC).
Mỗi ngày tiến hành đo mật số vi khuẩn bằng máy đo OD (550nm) và theo dõi nồng độ acid trong 7 ngày bằng phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,8N.
So sánh và tuyển chọn được các chủng AAB có khả năng lên men acid acetic tốt nhất.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn acid acetic
Với mục đích có thể phân lập các chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ ca cao, tổng cộng có 14 mẫu là các thành phần khác nhau của ca cao được thu thập tại Cần Thơ và Bến Tre để làm nguồn phân lập. Mẫu được cho vào môi trường YPGD (yeast extract 5 g/L, polypepton 5 g/L, glycerol 5 g/L, D-glucose 5 g/L) có bổ sung 4% v/v ethanol và ủ qua đêm. Cấy chuyển trên môi trường YPGD chứa 4% ethanol, 2% agar và 0,5% CaCO3 (ủ ở 30oC trong 2-3 ngày) để chọn các khuẩn lạc xuất hiện chủng halo trên môi trường (Hình 5).
Hình 6. Khuẩn lạc tạo vòng halo trên môi trường (a), môi trường đối chứng có CaCO3 (b) và không có CaCO3 (c)
Hình 7. Một số chủng AAB tạo vòng sáng halo trên môi trường.
Các khuẩn lạc đặc trưng được cấy chuyển nhiều lần trên môi trường YPGD chứa 4% ethanol, 2% agar và 0,5% CaCO3. Kết quả phân lập và làm thuần được 30 chủng vi khuẩn (Bảng 6).
a b c
Bảng 5. Số lượng các chủng vi khuẩn acid acetic phân lập từ ca cao
STT Địa điểm Mẫu Số chủng phân lập
1
Cần Thơ
Hoa ca cao 2
2 Lá ca cao 2
3 Vỏ ca cao 2
4 Hạt ca cao lên men 3
ngày 3
5 Hạt ca cao lên men 4
ngày 2
6 Hạt ca cao lên men 6
ngày 2 7 Hạt ca cao khô 3 8 Bến Tre Hoa ca cao 1 9 Lá ca cao 1
10 Hạt ca cao lên men 1
ngày 1
11 Hạt ca cao lên men 2
ngày 3
12 Hạt ca cao lên men 3
ngày 2
13 Hạt ca cao lên men 4
ngày 3
14 Hạt ca cao khô 3
Tổng cộng 30
4.2 Xác định hình thái, sinh lý, sinh hóa các chủng vi khuẩn acid acetic
Trong 30 chủng đã phân lập, các chủng vi khuẩn có hình dạng khuẩn lạc, hình dạng vi khuẩn và các đặc điểm sinh lý, sinh hóa như:
- Hình dạng khuẩn lạc: đa số khuẩn lạc hình tròn, một số khuẩn lạc không đều. (một số ít có bìa răng cưa).
- Màu sắc khuẩn lạc: đa số khuẩn lạc màu trắng đục, một vài chủng có màu vàng. - Hình dạng tế bào: hình cầu, hình que, que ngắn kết chuỗi, hình cầu kết chuỗi - Catalase: âm tính, dương tính.
Hình 8. Hình dạng vi khuẩn và hình nhuộm Gram trên kính hiển vi ở độ phóng đại 100X của một số chủng AAB
Phân loại các chủng vi khuẩn acid acetic
Hình 9: Sự biến đổi màu môi trường chỉ thị sau 48 giờ. Màu vàng (a) là
Gluconobacter, màu xanh lục (b) là Acetobacter, màu xanh lam (c) là môi trường
B3-2
C3-1
B2-2
Theo tài liệu định danh của Bergey (Holt et al., 1994), dựa vào phản ứng oxy hóa acetate sẽ phân lập thành hai giống Acetobacter và Gluconobacter. Cấy các chủng AAB trên môi trường YPGD bổ sung bromocresol green 0,02% ủ 30oC sau 24 giờ tất cả các chủng chuyển từ màu xanh lam sang màu vàng, nhưng sau 48-72 giờ, một số chủng AAB vẫn giữ môi trường màu vàng là Gluconobacter, còn một số chủng khác chuyển từ màu vàng thành màu xanh lục là Acetobacter. Kết quả định danh sơ bộ 30 chủng AAB thành 2 giống Acetobacter và Gluconobacter được liệt kê ở Bảng 7.
Bảng 6. Kết quả định danh sơ bộ các chủng AAB
STT Địa
điểm Loại mẫu
Chủng phân lập AAB Acetobacter Gluconobacter 1 Cần Thơ Lá ca cao CL1 x 2 CL2 x 3 Hoa ca cao CF1 x 4 CF2 x 5 Vỏ ca cao CV1 x 6 CV2 x 7
Hạt ca cao lên men 3 ngày
C3-1 x
8 C3-2 x
9 C3-3 x
10 Hạt ca cao lên men 4 ngày
C4-1 x
11 C4-2 x
12 Hạt ca cao lên men 6 ngày C6-1 x 13 C6-2 x 14 Hạt ca cao khô CK1 x 15 CK2 x 16 CK3 x 17 Bến Tre Lá ca cao BL1 x 18 Hoa ca cao BF1 x
19 Hạt ca cao lên men 1
ngày B1 x
20
Hạt ca cao lên men 2 ngày
B2-1 x
21 B2-2 x
22 B2-3 x
23 Hạt ca cao lên men 3 ngày
B3-1 x
24 B3-2 x
25
Hạt ca cao lên men 4 ngày B4-1 x 26 B4-2 x 27 B4-3 x 28 Hạt ca cao khô BK1 x 29 BK2 x 30 BK3 x
Như vậy, trong 30 chủng AAB đã phân lập được 17 giống Acetobacter (chiếm
56,7%), 13 giống Gluconobacter (chiếm 43,3%).
4.3 Thử nghiệm khả năng sinh acid acetic
Nuôi các chủng AAB trong ống nghiệm chứa môi trường YPGD lỏng trong 24 giờ. Nhỏ một giọt dung dịch nuôi cấy lên đĩa môi trường thạch màu xanh chứa bromocresol green đã chuẩn bị từ trước và đem ủ ở 30oC. Tiến hành đo vòng sáng màu vàng sinh ra sau 24 giờ và 48 giờ.
Hình 10. Sự biến đổi màu chỉ thị của một số vòng AAB ở 24 giờ (a) và môi tường đối chứng (b)
Các chủng vi khuẩn làm xuất hiện vòng sáng màu vàng xung quanh khuẩn lạc thể hiện khả năng sinh acid.
Từ kết quả ở Bảng 9, sơ tuyển được 17 chủng vi khuẩn có đường kính trung bình của vòng sáng từ 20 mm trở lên sau 48 giờ khi ủ ở 30oC được đánh giá là những chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid mạnh; 5 chủng có đường kính từ 12-17 mm được đánh giá là những chủng sinh acid trung bình; 8 chủng còn lại có đường kính vòng sáng từ 6-9mm được cho là những chủng sinh acid yếu.
Bảng 7. Đường kính vòng sáng của các chủng AAB
STT Địa
điểm Loại mẫu
Chủng phân lập Tạo acid (mm) Chọn 24 giờ 48 giờ 1 Cần Thơ Lá ca cao CL1 17 20 * 2 CL2 25 30 * 3 Hoa ca cao CF1 14 25 * 4 CF2 15 28 * 5 Vỏ ca cao CV1 15 30 * 6 CV2 7 7 7
Hạt ca cao lên men 3 ngày
C3-1 11 23 *
8 C3-2 8 9
9 C3-3 21 29 *
10 Hạt ca cao lên men 4 ngày
C4-1 5 8
11 C4-2 15 24 *
12 Hạt ca cao lên men 6 ngày C6-1 15 25 * 13 C6-2 18 27 * 14 Hạt ca cao khô CK1 6 6 15 CK2 14 22 * 16 CK3 7 8 17 Bến Tre Lá ca cao BL1 9 16 18 Hoa ca cao BF1 9 9
19 Hạt ca cao lên men 1
ngày B1 6 8
20
Hạt ca cao lên men 2 ngày
B2-1 7 17
21 B2-2 30 30 *
22 B2-3 18 24 *
23 Hạt ca cao lên men 3 ngày
B3-1 8 12
24 B3-2 16 27 *
25
Hạt ca cao lên men 4 ngày B4-1 12 24 * 26 B4-2 8 15 27 B4-3 10 14 28 Hạt ca cao khô BK1 13 26 * 29 BK2 7 7 30 BK3 13 28 *
Bảng 8. Đặc điểm của 17 chủng AAB được tuyển chọn STT Địa điểm Nguồn phân lập Chủng phân lập AAB C at al a se O xyda se Vùng sáng Hình dạng A G 24 giờ 48
giờ Khuẩn lạc Tế bào
1 Cần Thơ Lá CL1 x + - 17 20 Tròn, gò, nguyên, trắng đục Que ngắn, kết chuỗi 2 CL2 x + - 25 30 Tròn, mô, nguyên, vàng sậm Que 3 Hoa
CF1 x + - 14 25 Tròn, mô, răng cưa,