Phương trình phản ứng tổng quát của quá trình:
C6H12O6 2CH3–CHOH–COOH (CH3–CHOH–COO)2Mg
Mglucose = 180
Mmagie lactat = 238 (tính cho dạng dihydrat)
Từ kết quả định lượng đường trong mẫu khởi điểm và kết thúc, tra bảng ta được nồng độ % đường trong 2 mẫu, từ đó tính được lượng đường tiêu thụ.
Công thức tính hiệu suất tiêu thụ đường:
Trong đó:
H: hiệu suất (%).
m: số gam magie lactat/100ml dịch lên men.
a: C% glucose khởi điểm. b: C% glucose kết thúc.
2.3.8. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu
- Sử dụng phần mềm exel để tính toán và vẽ các biểu đồ. - Công thức tính độ lệch chuẩn.
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.3. Sơ bộ xác định quy trình ên men tạo magie lactat
Mục tiêu: Lựa chọn được quy trình lên men tạo magie lactat từ nguồn hydratcacbon, chủng lên men là L. acidophilus và tiến hành kiểm tra khẳng định sản phẩm tạo thành là magie lactat.
3.3.1. Lựa chọn thời điểm bổ sung MgCO3
Theo nghiên cứu của Aharon Meir Eyal, Rod Fisher, sản xuất magie lactat thông qua việc sinh tổng hợp axit lactic trong quá trình lên men. Nguyên liệu chính là các cacbohydrat cùng với các nguồn dinh dưỡng phù hợp 10]. Gerrit Leendert Nanninga và các cộng sự đã chỉ ra rằng magie lactat có thể d dàng thu được từ quá trình lên men của cacbohydrat thành axit lactic, trong đó muối magie không chỉ được sử dụng như một tác nhân trung hòa, mà còn tạo ra sản phẩm của quá trình lên men là magie lactat [17].
Chúng tôi tiến hành lên men theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2, sử dụng MgCO3 vào các thời điểm khác nhau:
Bắt đầu quá trình lên men (đối chiếu với sử dụng CaCO3).
Kết thúc quá trình lên men.
Trong quá trình lên men.
Đánh giá ảnh hưởng của thời điểm sử dụng MgCO3 đến khả năng tạo magie lactat để lựa chọn cách thích hợp áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Sử dụng MgCO3 ngay khi bắt đầu quá trình lên men:
Theo nghiên cứu của Lê Thị Thu Hiền, canxi lactat được tạo ra bằng cách thêm 5g CaCO3 vào môi trường ngay khi bắt đầu quá trình lên men, có cấy chủng L. acidophilus [5]. Magie và canxi là 2 kim loại cùng thuộc nhóm kim loại kiềm thổ nên tiến hành thí nghiệm lên men theo phương pháp đã nêu
ở mục 2.3.2, so sánh việc tạo thành magie lactat từ MgCO3 và canxi lactat từ CaCO3.
Tiến hành: 2 thí nghiệm
- Lên men theo phương pháp lên men đã nêu ở mục 2.3.2.
- Ngay khi bắt đầu quá trình lên men: Thí nghiệm 1: Thêm 5g MgCO3. Thí nghiệm 2: Thêm 5g CaCO3. - Sau 96 giờ lên men, thu dịch lên men, xử lí dịch lên men thu sản phẩm theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.3, cân lượng sản phẩm, định lượng đường theo phương pháp Schoorl – Regenbogen đã nêu ở mục 2.3.6.
Kết quả thực nghiệm được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. So sánh kết quả tổng hợp magie lactat và canxi lactat
Chất bổ sung (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các tiêu chí MgCO3 CaCO3
Lượng thêm vào (g) 5 5
pH bắt đầu ~ 10 ~ 6
pH kết thúc ~ 10 ~ 5
Lượng đường kết thúc (%) 6,93 0,31
Lượng sản phẩm Không thu được sản phẩm 3,21g
Nhận xét: Ở cùng điều kiện lên men, thí nghiệm thêm 5g CaCO3 thu được 3,21g sản phẩm, lượng glucose được tiêu thụ gần như hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của Lê Thị Thu Hiền [5] trong khi thí nghiệm thêm 5g MgCO3 không thu được sản phẩm, glucose hầu như không được tiêu thụ. Sở dĩ có sự khác nhau này do khi thêm 5g CaCO3 pH môi trường vẫn là 6, đây là pH thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của L. acidophilus. Khi thêm 5g MgCO3 môi trường lên men đạt pH = 10, ở pH này L. acidophilus bị ức chế, không đồng hóa được glucose để tạo axit lactic. Như vậy, MgCO3 thêm vào thời điểm ban đầu ảnh hưởng đến pH môi trường lên men nên ảnh hưởng khả năng đồng hóa glucose của vi khuẩn L. acidophilus.
Tiếp tục tiến hành với cách bổ sung MgCO3 ngay khi bắt đầu quá trình lên men nhưng với khối lượng giảm dần để khảo sát ảnh hưởng của khối lượng MgCO3 thêm vào ngay khi bắt đầu quá trình lên men có ảnh hưởng như thế nào tới pH môi trường lên men dẫn tới việc ảnh hưởng khả năng đồng hóa glucose của vi khuẩn L. acidophilus.
Tiến hành: 4 thí nghiệm
- Lên men theo phương pháp lên men đã nêu ở mục 2.3.2.
- Ngay khi bắt đầu quá trình lên men: Thêm vào mỗi bình lên men lượng MgCO3 lần lượt là 0,5g, 1g, 2g, 3g.
- Sau 96 giờ lên men, thu dịch lên men, xử lí dịch lên men thu sản phẩm theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.3, cân lượng sản phẩm, định lượng đường theo phương pháp Schoorl – Regenbogen đã nêu ở mục 2.3.6.
Kết quả thực nghiệm được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả tổng hợp magie lactat bằng cách thêm MgCO3 ngay khi bắt đầu quá trình lên men
Nhận xét: Với cách thêm MgCO3 (0,5 – 3g) ngay khi bắt đầu quá trình lên men đều không thu được hoặc thu được rất ít sản phẩm, lượng glucose hầu như không được tiêu thụ. Mặc dù khi lượng MgCO3 thêm vào giảm từ 3 xuống 0,5g, pH môi trường giảm , nhưng vẫn đạt pH = 8 khi chỉ thêm 0,5g MgCO3 đây vẫn thuộc khoảng pH ức chế L. acidophilus. Vậy MgCO3 thêm
Thí nghiệm
Các tiêu chí 1 2 3 4
Lượng MgCO3 thêm vào (g) 0,5 1 2 3
pH bắt đầu ~ 8 ~ 8 ~ 9 ~ 9
pH kết thúc ~ 7 ~ 7 ~ 9 ~ 9
Lượng đường kết thúc (%) 6,56 6,54 6,85 6,88
Lượng sản phẩm Thu được rất ít sản
phẩm
Không thu được sản phẩm
vào thời điểm ban đầu ảnh hưởng nhiều đến pH môi trường nên ảnh hưởng khả năng đồng hóa glucose tạo axit lactic của vi khuẩn. MgCO3 có pH = 8 – 10 [23] là tác nhân tạo ra môi trường lên men có pH = 8 – 10 ức chế sự phát triển và đồng hóa glucose của vi khuẩn L. acidophilus trong khi pH tối ưu của vi khuẩn này là pH = 5,5 – 6,5, kết quả này phù hợp với công bố của Aharon Meir Eyal, Rod Fisher [10].
Bổ sung MgCO3 khi kết thúc quá trình lên men.
Theo nghiên cứu của Novinyuk Lyudmila và Kykin Mikhail, magie lactat được tạo thành từ phản ứng hóa học giữa axit lactic do vi sinh vật sinh ra và MgCO3 [27]. Chúng tôi tiến hành lên men các cacbohydrat thành axit lactic bằng chủng L. acidophilus, khi kết thúc quá trình lên men bổ sung MgCO3 để tạo magie lactat.
Tiến hành:
- Lên men theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2.
- Sau 96 giờ kết thúc quá trình lên men, thêm MgCO3 điều chỉnh pH = 7, thu dịch lên men, xử lí dịch lên men thu sản phẩm theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.3, cân lượng sản phẩm, định lượng đường theo phương pháp Schoorl – Regenbogen đã nêu ở mục 2.3.6. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Lặp lại thí nghiệm 3 lần.
Kết quả thực nghiệm được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả tổng hợp magie lactat bằng cách sử dụng MgCO3 khi kết thúc quá trình lên men
Thí nghiệm
Các tiêu chí 1 2 3
pH kết thúc ~ 4 ~ 4 ~ 4
Lượng MgCO3 bổ sung (g) 2,24 1,99 2,03
Lượng đường kết thúc (%) 2,87 3,04 2,92
Nhận xét: Các thí nghiệm hầu như không thu được sản phẩm, lượng glucose vẫn được tiêu thụ, pH giảm chứng tỏ vi khuẩn vẫn đồng hóa glucose để tạo axit lactic. Nhưng không thu được sản phẩm, như vậy không có phản ứng hóa học xảy ra giữa axit lactic sinh ra với MgCO3 hoặc có phản ứng xảy ra nhưng quá yếu, không tạo đủ sản phẩm để thu được theo phương pháp đang nghiên cứu.
Theo nghiên cứu của Aharon Meir Eyal, Rod Fisher, trong quá trình lên men axit lactic được sinh ra nên vi sinh vật bị ức chế trong môi trường axit mạnh, vậy nên trong quá trình lên men phải thêm chất để duy trì được độ pH phù hợp [10]. Khi tiến hành theo cách này trong 96 giờ lên men, chúng tôi không thêm chất trung hòa axit nên ở môi trường axit mạnh, L. acidophilus bị ức chế khả năng sinh trưởng và tạo axit lactic, vì thế khi kết thúc quá trình lên men, lượng axit lactic quá ít không đủ phản ứng để tạo nhiều magie lactat.
Bổ sung MgCO3 sau mỗi 24 giờ trong quá trình lên men, điều chỉnh pH = 7
Theo nghiên cứu của Aharon Meir Eyal, Rod Fisher, axit lactic được sinh ra nên vi sinh vật bị ức chế trong môi trường axit mạnh. Trong quá trình lên men phải thêm chất để duy trì được độ pH phù hợp. Các chất phù hợp là các kim loại kiềm thổ, tốt hơn nữa là canxi hoặc magie, tốt nhất là nhóm cacbonat, bicacbonat [10]. Gerrit Leendert Nanninga và các cộng sự chỉ ra rằng MgCO3 thêm vào trong quá trình lên men của cacbohydrat thành axit lactic như một tác nhân trung hòa [17].
Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm lên men theo phương pháp mục 2.3.2 bổ sung MgCO3 dần dần vào các thời điểm 24, 48, 72, 96 giờ, duy trì pH = 7.
Tiến hành:
- Sau mỗi 24 giờ bổ sung MgCO3, điều chỉnh pH = 7.
- Sau 96 giờ lên men, thu dịch lên men, xử lí dịch lên men thu sản phẩm theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.3, cân lượng sản phẩm, định lượng đường theo phương pháp Schoorl – Regenbogen đã nêu ở mục 2.3.6, tính toán và xử lí số liệu theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.8.
- Lặp lại thí nghiệm 3 lần.
Kết quả thực nghiệm thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả tổng hợp magie lactat bằng cách bổ sung dần MgCO3 sau mỗi 24 giờ
Thí nghiệm
Các tiêu chí
Thời điểm (giờ) Tổng MgCO3 bổ sung (g) Lƣợng đƣờng tiêu thụ (%) Sản phẩm (g) 0 24 48 72 96 1 pH 6 5 4 5 6 4,18 100% 3,07 MgCO3 bổ sung (g) 0 1,1 1,43 1,11 0,54 2 pH 6 4 4 4 6 3,97 100% 2,81 MgCO3 bổ sung (g) 0 1,31 1,31 1,05 0,3 3 pH 6 5 4 4 6 4,23 100% 2,90 MgCO3 bổ sung (g) 0 1,03 1,44 1,4 0,36 Trung bình 4,127 100% 2,93
Nhận xét: Với phương pháp bổ sung MgCO3 sau mỗi 24 giờ và điều chỉnh pH = 7 trong suốt quá trình lên men đều thu được sản phẩm với khối lượng trung bình là 2,93g, độ lệch chuẩn 0,108.
Trong quá trình lên men, MgCO3 bổ sung không chỉ được sử dụng như một tác nhân trung hòa, mà còn tạo ra sản phẩm của quá trình lên men đó là
magie lactat, phù hợp với kết quả nghiên cứu của Gerrit Leendert Nanninga và các cộng sự 17].
Kết luận: Cách bổ sung dần MgCO3 sau mỗi 24 giờ, điều chỉnh pH = 7 là thích hợp nhất, lựa chọn phương pháp này cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2. Lựa chọn phương pháp thu sản phẩm magie lactat
Mục tiêu: Lựa chọn cách thu tinh thể kết tinh magie lactat thích hợp nhất từ dịch lên men.
Ben - Yoseph Eliahu, Kogan Leni, Wajc Samuel đã chỉ ra rằng ở giai đoạn tinh chế: dịch lên men sau khi loại bỏ sinh khối thường chứa khoảng 5,5% khối lượng magie hay canxi lactat, được tính như axit lactic. Nồng độ này không đủ để kết tinh ở nhiệt độ môi trường xung quanh. Do đó, dịch lên men được cô còn khoảng 15%, làm lạnh, lọc hoặc ly tâm, và rửa sạch [11].
Tiến hành các cách thu sản phẩm khác nhau để lựa chọn được cách tối ưu nhất thu sản phẩm phù hợp với tính chất của magie lactat ở mục 1.1.1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành:
- Tiến hành lên men theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2 và bổ sung dần dần MgCO3 sau mỗi 24 giờ, điều chỉnh pH = 7.
- Sau 96 giờ lên men, xử lí dịch lên men theo phương pháp nêu ở mục 2.3.3, trong đó các phương pháp thu tinh thể sau khi để kết tinh được nghiên cứu lần lượt là:
+ Lọc hút qua ph u Buchner, đường kính giấy lọc 0,45 mcm; + Li tâm ở nhiệt độ thường (4000 vòng / 5 phút);
+ Li tâm lạnh ở 20C (8000 vòng / 10 phút). - Làm song song 3 bình thí nghiệm.
Cân sản phẩm, so sánh lượng sản phẩm thu được ở mỗi phương pháp, nhận xét và rút ra kết luận.
Kết quả thu magie lactat được thể hiện trong bảng 3.5.
ảng 3.5. Lượng sản phẩm magie lactat thu được bằng các phương pháp: ph u lọc uchner, li tâm thường, li tâm lạnh
Phƣơng pháp thu tinh thể Giai đoạn Phễu ọc Buchner Li tâm thƣờng Li tâm ạnh
Lọc nóng Ph u Buchner Ph u Buchner Ph u Buchner
Kết tinh Tủ lạnh Tủ lạnh Tủ lạnh
Thu sản phẩm Ph u Buchner Li tâm thường Li tâm lạnh
Rửa tủa Nước lạnh
+ Ph u Buchner
Nước lạnh + Li tâm thường
Nước lạnh + Li tâm lạnh
Sấy Tủ sấy Tủ sấy Tủ sấy
Lượng sản phẩm (g) 0,46 1,41 3,08
Nhận xét: Với phương pháp lọc hút qua ph u uchner, lượng sản phẩm thu được rất ít do tinh thể quá nhỏ và mịn nên sản phẩm thất thoát gần hết qua giấy lọc.
Phương pháp li tâm giúp hạn chế sự thất thoát sản phẩm qua giấy lọc do độ mịn của tinh thể, lượng sản phẩm thu được nhiều hơn so với phương pháp lọc hút qua ph u uchner. Tuy nhiên khi tiến hành li tâm, nhiệt độ tăng làm thất thoát một phần sản phẩm vào dịch lọc và nước rửa, do độ tan của magie lactat tăng lên khi tăng nhiệt độ, phù hợp với tính chất của magie lactat [23].
Phương pháp li tâm lạnh giúp khắc phục được sự thất thoát sản phẩm do tăng nhiệt độ khi li tâm, lượng sản phẩm thu được đạt nhiều nhất trong các phương pháp nghiên cứu.
Sản phẩm thu được dạng tinh thể khối hình thuôn dài màu trắng, không mùi. Kết quả này đúng như công bố của Gerrit Leendert Nanninga và các cộng sự, magie lactat kết tinh thu được dạng tinh thể khối hình thuôn dài. Do
sự kết tinh chậm, nên không có tạp chất kết tinh cùng với các tinh thể magie lactat và hình thành các tinh thể với một hình dạng xác định rõ ràng. Vì vậy, bước kết tinh vốn đã là một bước lọc hiệu quả. Magie lactat thu được rất tinh khiết [17].
Hình 3.1. Tinh thể magie lactat
Kết luận: Phương pháp li tâm lạnh (20C, 8000 vòng / 10 phút) cho kết quả thu sản phẩm magie lactat tốt nhất trong các phương pháp nghiên cứu, được lựa chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.2. Sơ đồ quy trình xử lí dịch lên men
3.3.3. Định tính sản phẩm magie lactat thu được
Mục tiêu: Kiểm tra sản phẩm tạo thành có phải magie lactat không. Sản phẩm tạo thành là magie lactat được cấu tạo bởi ion Mg2+ và ion lactat nên tiến hành các phản ứng hóa học đặc trưng xác định sự có mặt của 2 ion. Đồng thời, tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng đối chiếu giữa 3 mẫu: sản phẩm điều chế được bằng phương pháp sinh tổng hợp, magie lactat tổng hợp bằng phương pháp hóa học và magie lactat trong thành phần thuốc đang lưu hành (Magie B6). Từ đó khẳng định sản phẩm điều chế được có phải là magie lactat.
Dịch lên men Đun nóng
Lọc nóng Cô Kết tinh Li tâm lạnh Sấy 800C/ 20 phút Ph u Buchner 40C/ 24 giờ 20C/ 8000 vòng/ 10 phút 400C/ 24 giờ Sản phẩm thô (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thử định tính ion lactat:
Tiến hành theo phương pháp định tính ion lactat đã nêu ở mục 2.3.4. Kết quả thực nghiệm được thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Vòng màu lục xuất hiện khi định tính ion lactat
Nhận xét: Kết quả định tính có vòng màu lục xuất hiện giữa bề mặt phân cách 2 chất lỏng như trong DĐVN IV [2] mô tả.
Kết luận: Có phản ứng của ion lactat.
Thử định tính ion Mg2+:
Tiến hành theo phương pháp định tính Mg2+ đã nêu ở mục 2.3.4. Kết quả thực nghiệm được thể hiện ở hình 3.4 – 3.5.
Hình 3.4. Tủa trắng xuất hiện khi thêm dung dịch NH3 và tan khi thêm dung dịch amoni clorid
Hình 3.5. Dung dịch trong suốt sau khi thêm dung dịch amoni clorid và xuất hiện tủa kết tinh trắng khi thêm dung dịch Na2HPO4
Nhận xét: Kết quả thu được đúng như mô tả trong DĐVN IV [2]. Kết luận: Có phản ứng của ion Mg2+.
Định tính magie lactat dihydrat bằng sắc ký lớp mỏng