Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết được khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, dạng thù hình, điểm nóng chảy, độ tan. Khi các chất đủ sạch, tiến hành ghi các phổ: phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân
proton (1H-NMR), 13C-NMR), phổ DEPT, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều HMBC và HSQC. Các dữ liệu phổ thu được dùng để xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập.
CHƯƠNG 3
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. CHIẾT XUẤT
3.1.1. Xác định độ ẩm dược liệu
Lấy khoảng 2g bột dược liệu để xác định độ ẩm. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 1100
C. Trải đều dược liệu lên đĩa cân, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiển thị kết quả.
Độ ẩm dược liệu là 15,93%.
3.1.2. Chiết xuất
Cân chính xác khoảng 950g bột dược liệu khô, chiết bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng với dung môi methanol 80% (làm 3 lần, mỗi lần 2 ngày). Lọc, dịch lọc được gộp chung, đem cất thu hồi dung môi và cô đến khối lượng không đổi thu được 58,39g cắn toàn phần. Cắn được hòa tan vào nước cất nóng 60°C. Dịch chiết nước được tiến hành chiết lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, chloroform, ethylacetat. Thu được 3 phân đoạn dịch chiết. Các dịch chiết được cất thu hồi dung môi đến cắn có khối lượng không đổi, kí hiệu tương ứng là cắn H, cắn C và cắn E. Quá trình chiết xuất được tiến hành như trong hình 3.1.
Hiệu suất của cắn 3 phân đoạn so với cắn toàn phần và so với bột cây cỏ Seo gà đem đi chiết được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ cây cỏ Seo gà.
STT Phân đoạn Khối lượng cắn
(g)
% so với cắn toàn phần
% so với nguyên liệu khô
1 n-hexan 16,67 28,55 2,09
2 Chloroform 10,00 17,13 1,25
Dược liệu
Dịch chiết methanol
Methanol. Lọc
Cắn toàn phần Methanol thu hồi
Dịch chiết nước
Nước cất 600
C
n-hexan
Dịch chiết n-hexan
n-hexan thu hồi
Cắn H Dịch chiết nước Dịch chiết chloroform chloroform Chloroform Cắn C CHCl3 thu hồi Dịch chiết nước Ethylacetat Dịch chiết nước Dịch chiết ethylacetat Cắn E
Ethylacetat thu hồi
Phân đoạn ethylacetat được lựa chọn để tiến hành phân lập chất tinh khiết.
3.1.3. Định tính một số nhóm chất trong phân đoạn ethylacetat bằng phản ứng hóa học. phản ứng hóa học.
Tiến hành định tính mẫu nghiên cứu các nhóm chất thường gặp trong phân đoạn ethylacetat của dược liệu bằng các phản ứng hóa học, kết quả được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả định tính một số nhóm chất trong cắn ethylacetat.
Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận
1 Flavonoid
Phản ứng Cyanidin ++
Có Phản ứng với dung dịch kiềm loãng ++
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% +++
Phản ứng diazo hóa + 2 Coumarin Phản ứng mở, đóng vòng lacton + Có Phản ứng diazo hóa + Phản ứng huỳnh quang + 3 Tanin
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% ++
Không có Phản ứng với dung dịch gelatin 1% -
Phản ứng với dd chì acetate 10% ++ Ghi chú : (-) phản ứng âm tính
(+) phản ứng dương tính (++) phản ứng dương tính rõ
Nhận xét: Bằng các phản ứng hóa học thường quy, kết quả cho thấy trong cắn
phân đoạn ethylacetat của cây cỏ Seo gà có chứa các nhóm chất: flavonoid, coumarin; không chứa tanin.
3.1.4. Định tính cắn phân đoạn ethylacetat bằng SKLM
+ Mẫu thử : cắn ethylacetat được hòa tan trong methanol.
+ Bản mỏng silica gel GF254 (Merck) tráng sẵn, được hoạt hóa ở 110°C trong 1h. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm.
Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi
Hệ I: Toluen - ethylacetat - acid formic (6:2:1) Hệ II: Toluen - ethylacetat - acid formic (5:4:1) Hệ III: Ethylacetat - methanol (8,5:1)
Hệ IV: Ethylacetat - methanol - H2O (8:1:1) Hệ V: Ethylacetat - acid formic - H2O (10:1,35:1)
Thuốc thử hiện màu: dd vanilin/H2SO4 10% và soi dưới đèn tử ngoại bước sóng 254nm và 366nm.
- Tiến hành: chấm dịch chiết methanol lên bản mỏng. Sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình, sấy nhẹ 5 phút cho bay hơi hết dung môi. Phát hiện vết dưới ánh sáng tử ngoại. Sau đó phun thuốc thử hiện màu, sấy ở nhiệt độ khoảng 110°C. Sau nhiều lần triển khai thấy hệ V tách tốt nhất (hình 3.2). Kết quả định tính bằng SKLM của cắn toàn phần với hệ dung môi V được trình bày ở bảng 3.3:
Hình 3.2 : Sắc ký đồ của cắn ethylacetat với hệ dung môi V
1. không phun TT, AST 3. không phun TT, UV366nm
2. không phun TT, UV254nm 4. phun TT, AST
Bảng 3.3. Màu sắc và giá trị Rf của cắn ethylacetat trên SKLM với hệ dung môi khai triển V
STT Không có thuốc thử Có thuốc thử Rf x 100
AST UV254nm UV366nm AST 1 Đen + XD + Đen + 10,1 2 XD + 19,73 3 Đen + Đen + 22,12 4 Đen ++ 26,73 5 XD + 29,36 6 Đen ++ 31,17 7 XLM + Đen + 35,46 8 Đen ++ XD ++ Đen +++ 38,18 9 Đen +++ Vàng +++ 43,20 10 XD ++ Hồng + 47,25 1 2 3 4
11 Đen +++ 54,5 12 Đen + 56,07 13 Đen +++ 60,91 14 Hồng +++ 68,18 15 Vàng + Đen +++ Đen +++ 72,27 16 XD + ++ 77,06 17 Vàng + 79,44 18 Đen +++ XD +++ Đen + 81,1 19 Vàng + XLM ++ 83,49 20 XNB +++ 89,91 Ghi chú: (+) Mờ (++) Rõ (+++) Rất rõ 3.2. PHÂN LẬP 3.2.1. Phân lập
Cắn ethylacetat (8,20g) được hòa tan bằng lượng dung môi methanol tối thiểu và được trộn với một lượng tối thiểu silica gel, làm khô cho đến khi thu được bột tơi. Hỗn hợp này sau đó được tiến hành phân tách bằng sắc ký cột, rửa giải bằng hệ dung môi gradient dichlomethan : methanol với độ phân cực tăng dần (tỉ lệ 20:1, 10:1, 5:1 và 0:1), kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, gộp các phần giống nhau thu được 4 phân đoạn chính là F9, F10, F11, F12.
Phân đoạn F11 tiến hành sắc ký trên cột pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi methanol : nước (1:1) thu được 2 phân đoạn F11A và F11B.
Phân đoạn F11B tiếp tục tinh chế trên cột pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi aceton : nước (1:2,3) thu được chất PM9 (30 mg).
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập PM9 từ phân đoạn ethylacetat chiết xuất từ cây cỏ Seo gà.
3.2.2. Kiểm tra độ tinh khiết của chất PM9
PM9 được khai triển với 3 hệ dung môi
Hệ I : Ethylacetat : acid formic (8:1)
Hệ II : Dichlomethan : methanol : nước (4:1:0,1) Hệ III : Ethylacetat : methanol: nước (6:1:0,1)
Cắn ethylacetat (8,20g)
F10
F11B
PM9 (30mg)
CC, silica–gel
Gradient dichlomethan : methanol
YMC, silica gel
methanol : nước (1:1)
YMC, silica gel aceton : nước (1:2,3)
Kết quả : + ở ánh sáng UV254nm PM9 chỉ xuất hiện một vết.
+ sau khi phun thuốc thử (dd H2SO4 10%) ở AST PM9 cũng chỉ xuất hiện một vết màu vàng với cả 3 hệ dung môi.
Vì vậy sơ bộ kết luận PM9 là một chất tinh khiết.
Hình 3.4. : Hình ảnh SKLM của PM9 với 3 hệ dung môi ở UV254nm
Hình 3.5. Hình ảnh SKLM của PM9 với 3 hệ dung môi sau khi phun TT quan sát ở AST.
Bảng 3.4. : Kết quả SKLM của PM9 với 3 hệ dung môi ở UV254nm và sau khi phun TT quan sát ở AST.
Hệ dung môi I II III
UV254nm Rf x 100 41,67 20 45,31
Màu sắc Đen Đen Đen
Sau khi phun TT ở AST
Rf x 100 41,67 20 45,31
Màu sắc Vàng Vàng Vàng
Sắc ký so sánh PM9 với cắn ethylacetat trên cùng một bản mỏng, dung môi khai triển là hệ dichlomethan : methanol : nước (4:1:0,1).
Kết quả thể hiện trên hình 3.6.
Hình 3.6. Sắc ký so sánh PM9 với cắn ethylacetat ở UV254nm
3.3. NHẬN DẠNG HỢP CHẤT PM9
- Tính chất: PM9 là dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt. Nhiệt độ nóng chảy là: 201-2030C. Tan trong ethanol hoặc DMSO. Có công thức phân tử C27H30O14, M= 578.
Hình 3.7. Ảnh tinh thể của PM9 dưới kính hiển vi vật kính 40
Phổ 1H-NMR của PM9 cho 4 tín hiệu của proton thơm tại δH 6,45 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,77 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 7,79 (2H, d, J = 9,0 Hz, H- 2’), 6,92 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3’) gợi ý về một khung flavonoid dạng kaempferol. Ngoài ra, 2 proton anome của 2 phân tử đường xuất hiện ở vị trí cộng hưởng δH 5,30 (H-1”, s) và 5,54 (H-1’’’, S ); 2 nhóm methyl bậc 3 được nhận biết ở các vị trí cộng hưởng δH 0,81 (3H, d, J = 5,5 Hz, H-6’’) và 1,13 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-6’’’) cho thấy sự có mặt của 2 đường gốc rhamnosyl.
Trên phổ 13C-NMR và DEPT của PM9 đếm được 27 nguyên tử carbon, trong đó có 9 carbon bậc IV, 16 carbon bậc III và 2 nhóm methyl. Sự chuyển dịch về phía trường mạnh của 2 tín hiệu carbon methin tại 99,52 (C-6) và 94,70 (C-8) khẳng định vòng A ở đây bị thế 2 vị trí 5,7. Bên cạnh đó cũng quan sát thấy 2 tín hiệu carbon anome tại δC 101,96 (C-1”) và 98,53 (C-1”’); 2 nhóm methyl tại các vị trí cộng hưởng δC 17,50 (C-6’’) và 17,94 (C-6’’’); một nhóm carbonyl tại vị trí cộng hưởng δC 178,02 (C-4). Từ các dữ kiện trên cho phép ta khẳng định PM9 là một kaempferol chứa 2 phân tử đường.
Để khẳng định chính xác cấu trúc hóa học, chúng tôi tiến hành phân tích phổ 2 chiều HMBC và HSQC. Các tín hiệu proton được gán với các tín hiệu carbon tương ứng dựa vào phổ 2 chiều HSQC. Các vị trí liên kết được khẳng định bằng kết quả phân tích phổ 2 chiều HMBC. Trên phổ HMBC quan sát thấy tương tác giữa proton anome 5,30 (H-1”) với tín hiệu carbon 134,66 (C-3); tương tác giữa proton anome 5,54 (H-1”’) với tín hiệu carbon 161,80 (C-7). Điều này cho phép khẳng định 2 phân tử đường liên kết trực tiếp với vị tí C-3 và C-7. Các tín hiệu carbon oximethin của 2 phân tử đường này nằm trong khoảng từ 69,79 - 71,23 (8 tín hiệu CH) và có thể hoán đổi lẫn nhau. Kết hợp so sánh với số liệu phổ của PM9 với hợp chất kaempferol-3,7- di-O-α-L-rhamnopyranosid [27] thấy hoàn toàn phù hợp tại các vị trí tương ứng. Do đó, hợp chất PM9 được xác định là kaempferol-3,7-di-O-α-L- rhamnopyranosid , hay còn có tên là kaempferitrin.
Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NRM của PM9
No. &δC [27] δCa,b δHa,c
(mult., J in Hz) HMBC (HC) 1 2 158,3 157,89 - 3 135,0 134,66 - 4 178,0 178,02 - 5 161,5 161,80 - 6 100,0 99,52 6,45 (d, 2,0) 5, 8, 10 7 162,3 161,80 - 8 95,0 94,70 6,77 (d, 2,0) 6, 7, 9, 10 9 156,6 156,22 - 10 106,3 105,88 - 1’ 121,0 120,48 -
2’ 131,2 130,79 7,79 (d, 9,0) 2, 4’ 3’ 116,0 115,48 6,92 (d, 8,5) 1’, 4’ 4’ 160,7 160,19 - 5’ 116,0 115,48 6’ 131,2 130,49 Rhamnosid 1’’ 102,4 101,96 5,30 (s) 3 2’’ 70,9 69,79-71,23 3,12-4,10 3’’ 70,6 4’’ 72,2 5’’ 71,7 6’’ 18,0 17,50 0,81 (d, 5,5) Rhamnosid 1”’ 99,3 98,53 5,54 (s) 7 2’’’ 70,8 69,79-71,23 3,12-4,10 3’’’ 70,6 4’’’ 71,2 5’’’ 70,3 6’’’ 18,5 17,94 1,13 (d, 6,5)
aĐo trong DMSO, b
125 MHz, c500 MHz.
Hình 3.8: Cấu trúc hóa học của hợp chất PM9
3.4. BÀN LUẬN
Cây cỏ Seo gà là một dược liệu được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới đặc biệt là ở Trung Quốc, Đài loan, Ấn Độ… Nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây cỏ Seo gà cho thấy dược liệu này có khả năng ức chế tế bào ung thư, chống đột biến, hạ lipid máu, chống phì đại tuyến tiền liệt lành tính… Mặc dù có nhiều tác dụng vượt trội như vậy nhưng việc nghiên cứu về cây cỏ Seo gà tại Việt Nam vẫn còn rất ít, đặc biệt là việc chiết tách các thành phần hóa học có tác dụng dược lý để chứng minh cho kinh nghiệm sử dụng dược liệu này trong dân gian. Do đó việc tiến hành nghiên cứu đề tài này là cần thiết, góp phần khẳng định và nâng cao giá trị sử dụng của dược liệu này.
Đề tài đã tiến hành định tính sơ bộ phân đoạn ethylacetat, kết quả cho thấy trong phân đoạn ethylacetat có chứa: flavonoid, coumarin.
Trên thế giới, các nhà khoa học đã phân lập được một số chất từ cây cỏ Seo gà như vicenin-2, lonicerin, rhoifolin, luteolin, apigeni [25] và multifidosid A, B, C [40], [41]. Đề tài này đã phân lập được 1 hợp chất là PM9. Dựa vào dữ liệu phổ MS, 1D- và 2D-NMR đã nhận dạng PM9 là kaempferitrin.
Kaempferitrin được biết đến là một kaempferol glycosid tự nhiên có trong nhiều cây thuốc, nó được tìm thấy trong sài hồ bắc, dâm dương hoắc lá hình
tim, Bauhinia forficate, Tilia laburnum, Lespedeza cyrtobotrya, Cinnamomum
osmophloeum Kaneh…, phân bố rộng rãi trong các họ thực vật như Apiaceae,
Asteraceae, Fabaceae, Berberidaceae, Malvaceae, Lauraceae. Năm 2009, Yerra Koteswara Rao và cộng sự đã phân lập được kaempferitrin từ dịch chiết n-butanol và dịch chiết nước của lá cây Cinnamomum osmophloeum bằng phương pháp sắc kí cột với chất nhồi cột là silica gel [29], [31]. Ngoài ra, kaempferitrin cũng được phân lập từ dịch chiết n-butanol của lá cây Bauhinia
forficate [16]. Tác dụng dược lý của kaempferitrin đã được chứng minh qua
nhiều nghiên cứu. Theo đó, chất có tác dụng kháng khuẩn như một kháng sinh [31], chống viêm [18], chống oxy hóa [16], chống kí sinh trùng [22], bắt chước insulin, hạ đường huyết [23], [31], hạ lipid máu [24], chống ung thư [15], bảo vệ màng tế bào thận [38] và kích thích miễn dịch thông qua trung gian tế bào [17]. Đặc biệt là tác dụng hạ đường huyết của nó, đã có nhiều nghiên cứu của một số nhà khoa học chỉ ra rằng kaempferitrin có tác dụng hạ đường huyết cấp ở những con chuột mắc bệnh tiểu đường và kích thích sự hấp thu glucose vào trong tế bào, hiệu quả tương tự như insulin trong cơ dép ở chuột bình thường. Bằng chứng đầu tiên cho thấy tác dụng đặc biệt này của kaempferitrin là việc kích thích sự hấp thu [U-14C]-2-deoxi-D-glucose vào các tế bào cơ như một hệ quả của sự biến đổi các hoạt động nội tại trong quá trình vận chuyển glucose [23]. Thêm vào đó một nghiên cứu khác chỉ ra rằng kết quả khi điều trị bằng kaempferitrin làm tăng tốc độ của quá trình phosphoryl hóa trên thụ thể insulin beta và thụ thể insulin nền 1. Và nó cũng kích thích tiết adiponectin bền vững hơn insulin. Đây chính là bằng chứng cụ thể về tác động kép của kaempferitrin. Nó vừa cải thiện tình trạng kháng insulin bằng cách kích hoạt các đường dẫn truyền insulin cổ điển, vừa kích thích tăng tiết adiponectin [31]. Mặt khác, theo Ting-Yu Lin và cộng sự, 2 hoạt chất chính trong đó có kaempferitrin được phân lập từ dịch chiết nước
của cây C.osmophloeum có tác dụng làm giảm lipid máu, cụ thể là giảm cholesterol toàn phần, triglycerid và lipoprotein tỷ trọng thấp ở chuột có chế độ ăn giàu chất béo [24].
Đối với cỏ Seo gà thu hái tại Ba Vì - Hà Nội, kaemferitrin là hợp chất lần đầu phân lập được từ mẫu nghiên cứu này. Theo kinh nghiệm của người dân Ba Vì, cỏ Seo gà được dùng để điều trị các bệnh như lở ngứa, bệnh ngoài da, kiết lỵ, tiêu chảy. Bên cạnh đó theo kinh nghiệm của nhiều vùng miền có loài cây này cho biết, cỏ Seo gà còn được dùng để trị giun, eczema, viêm ruột, viêm đường tiết niệu, viêm họng, viêm tuyến nước bọt, sưng vú... [9], [13], đồng thời theo nghiên cứu của một số nhà khoa học, cỏ Seo gà có tác dụng hạ lipid máu [33] và chống ung thư [26], [30]. Như vậy, việc phân lập được kaempferitrin là một đóng góp mới của khóa luận, bổ sung thêm các chất phân lập từ cây cỏ Seo gà. Sự có mặt của kaempferitrin trong cây cỏ Seo gà với những tác dụng được biết đến của chúng bước đầu hướng đến việc chứng minh tác dụng dược lý cũng như kinh nghiệm sử dụng vị thuốc này trong dân gian, mở ra hướng mới để nghiên cứu sâu hơn về tác dụng sinh học của cây cỏ Seo gà. Nhận thấy vai trò ngày càng quan trọng của kaempferitrin, con người đang tích cực đầu tư cho nghiên cứu phân lập hợp chất này từ nhiều nguồn khác nhau. Vì vậy, việc phân lập ra kaempferitrin từ cây cỏ Seo gà là định hướng mở rộng nguồn dược liệu có giá trị khai thác kaempferitrin tại Việt Nam. Tuy nhiên, cần tiến hành xác định hàm lượng kaempferitrin trong cây cỏ Seo gà để làm cơ sở cho việc khai thác.