2.1.1.1. Nguyên tắc
Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích lý hoá, dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hoà tan lẫn vào nhau: Pha tĩnh (Trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tuỳ thuộc vào bản chất của cột và chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi vào pha động vào cột thì tuỳ thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra máy in.
2.1.1.2. Cơ sở lý thuyết
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột. Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và pha động mà quá trình rửa giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc đồ [8], [11].
2.1.1.3. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính sau:
* Hệ thống bơm
Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 - 400 bar)
* Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ. Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm ) và đuổi khí hòa tan.
*Hệ tiêm mẫu
Để đưa mẫu phân tích vào cột.
Có nhiều phương pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động. Mẫu thử (dạng lỏng hay dạng rắn) đều phải hoà tan trong dung môi thích hợp rồi lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi tiêm.
* Cột sắc ký lỏng HPLC
Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được với áp suất cao đến vài trăm bar.
- Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha tĩnh có đường kính rất nhỏ (3, 5, 10 µm).
- Đường kính cột: 4 hoặc 4,6 mm. Nói chung, cột HPLC có tuổi thọ khá dài nếu ta sử dụng đúng cách. Nếu sử dụng không đúng cách tuổi thọ của cột sẽ giảm. Ví dụ dung môi có tính chất acid mạnh hoặc base mạnh hoặc tiêm liên tiếp các mẫu sinh học hay nguyên liệu bẩn thì tuổi thọ của cột sẽ bị giảm.
* Detector trong HPLC
Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay sử dụng là detector hấp
hoạt động của phương pháp đo quang phổ hấp thụ. Ngoài ra còn có detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hóa.
* Thiết bị hiển thị kết quả
Có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi các tín hiệu dưới dạng pic.