- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi cây Ba Kích tím in vitro
- Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ cây Ba Kích tím in vitro
- Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng thích ứng cây Ba Kích in vitro
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Điều kiện thí nghiệm: Tiến hành trong điều kiện nhân tạo với thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày, nhiệt độ: 270C.
- Môi trường MS được chuẩn bị gồm 5 phần: MS1, MS2, MS3, MS4, MS5. Thành phần các chất trong môi trường MS và nồng độ các chất trong dung dịch mẹ được trình bày ở phụ lục 1.
- Môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962), 8 g/l agar, 30 g/l đường saccharose, bổ sung than hoạt tính và các chất kích thích sinh trưởng ở các nồng độ
khác nhau tùy nội dung thí nghiệm, pH môi trường 5,8.
- Rót môi trường nuôi cấy vào các bình tam giác dung tích 250ml, mỗi bình chứa 30ml môi trường nuôi cấy.
- Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy ở áp suất 1atm, nhiệt độ 117 oC trong 15 phút.
3.4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của BAP tới khả năng nhân chồi cây ba kích in vitro.
Môi trường nền: MS + đường 30g/l + agar 6g /l
- Thí nghiệm gồm 4 công thức khác nhau về nồng độ BAP như sau:
STT Công thức thí nghiệm Nồng độ BAP (mg/l) Tổng số lƣợng mẫu
1 NC1 0,0 90
2 NC2 1,0 90
3 NC3 2,0 90
4 NC4 3,0 90
- Vật liệu thí nghiệm là các đoạn thân cây ba kích in vitro có chiều dài 2,5 cm, mang 2 cặp lá, không mang chồi đỉnh
- Thí nghiệm tiến hành với tổng số 360 chồi, 3 lần lặp, mỗi lần lặp 120 mẫu, mỗi công thức thí nghiệm tiến hành với 30 chồi được cấy vào 06 bình môi trường, mỗi bình chứa 5 mẫu.
- Sau sáu tuần nuôi cấy, các chỉ tiêu theo dõi được tổng hợp và phân tích kết quả. Các chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu tạo chồi, số chồi trung bình/mẫu, số lá trung bình/chồi, chiều cao trung bình chồi.
3.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của IBA tới khả năng ra rễ cây ba kích in vitro
- Môi trường nuôi cấy cơ bản: MS + đường 30g/l + 0,4 g/l than hoạt tính - Thí nghiệm gồm 5 công thức khác nhau về nồng độ IBA như sau:
STT Công thức thí nghiệm Nồng độ IBA Tổng số lƣợng mẫu
1 RR1 0,0mg/l 90
2 RR2 0,1mg/l 90
3 RR3 0,2mg/l 90
4 RR4 0,3mg/l 90
- Vật liệu thí nghiệm là các đoạn ngọn thân ba kích in vitro có chiều dài 2,5 cm mang 3 cặp lá.
- Thí nghiệm tiến hành với tổng số 450 mẫu, 3 lần lặp, mỗi lần lặp 150 mẫu, mỗi công thức thí nghiệm tiến hành với 30 mẫu được cấy vào 06 bình môi trường, mỗi bình chứa 5 mẫu.
- Sau bốn tuần nuôi cấy, các chỉ tiêu theo dõi được tổng hợp và phân tích kết quả. Các chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ trung bình/mẫu, chiều dài trung bình rễ, số lá trung bình/chồi, chiều cao trung bình chồi.
3.4.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của loại giá thể đến khả năng thích ứng cây Ba Kích in vitro
- Điều kiện thí nghiệm: Điều kiện ánh sáng tán xạ và che mưa bằng cách làm dàn che bằng lưới đen và nilon trắng, cách ly côn trùng bằng lưới trắng.
- Thí nghiệm gồm 4 công thức khác nhau về loại giá thể như sau:
STT Công thức thí
nghiệm Loại giá thể (theo thể tính)
Tổng số lƣợng mẫu 1 GT1 100% đất thịt nhẹ 120 2 GT2 50% đất thịt nhẹ + 50% cát 120 3 GT3 50% đất thịt nhẹ + 50% sơ dừa vụn 120 4 GT4 50% đất thịt nhẹ + 50% trấu hun 120
- Vật liệu thí nghiệm là cây Ba Kích in vitro đã được cấy trên môi trường ra rễ sau 28 ngày, cây có chiều cao 3,0 cm, mang 5 -7 cặp lá, mang 5-7 rễ dài 2,0 – 3,0 cm.
- Thí nghiệm tiến hành với tổng số 360 mẫu, mỗi công thức thí nghiệm tiến hành với 90 mẫu, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp 30 mẫu.
- Cây Ba Kích in vitro đạt tiêu chuẩn được lấy ra khỏi bình nuôi cấy, rửa sạch môi trường thạch bám xung quanh rễ, trồng cây vào các giá thể tương ứng, tưới nước bằng cách phun sương.
- Trong 1 tuần đầu, các cây được đặt ở nhiệt độ 270C và che kín bằng túi nilon trắng để tránh sự thoát hơi nước quá nhanh của cây in vitro khi thích ứng với môi trường bên ngoài, theo dõi thường xuyên độ ẩm của giá thể để điều chỉnh cho phù hợp. - Sau 1 tuần trồng cây ra giá thể, cây được đưa ra vườn ươm. Khu vực ươm cây được thiết kế che bằng 2 lớp: lớp nilon trắng nhằm tránh mưa, lớp lưới đen để hạn chế cường độ ánh sáng đảm bảo độ ẩm giúp cho cây hạn chế mất nước. Giữ ẩm cho cây
lần/ngày.
- Sau bốn tuần đưa cây con in vitro ra giá thể, các chỉ tiêu theo dõi được tổng hợp và phân tích kết quả. Các chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ cây sống, số lá, chiều cao cây
3.4.4. Phƣơng pháp thu thập và xử lý số liệu kết quả nghiên cứu.
Các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm được bố trí nhắc lại 3 lần mỗi công thức, mỗi lần 30 mẫu. Các chỉ tiêu theo dõi được tính toán dựa vào các công thức sau:
* Các chỉ tiêu đánh giá khả năng nhân chồi:
Tổng số mẫu bật chồi
Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy ban đầu Tổng số chồi Số chồi TB trên mẫu (chồi/mẫu) =
Tổng số mẫu bật chồi Tổng số lá
Số láTB /chồi (lá/chồi ) =
Tổng số chồi
Tổng chiều cao chồi Chiều cao TB chồi (cm) =
Tổng số chồi
* Các chỉ tiêu đánh giá khả năng ra rễ:
Tổng số chồi ra rễ Tỷ lệ ra rễ (%) = x 100 Tổng số chồi cấy Tổng số rễ Số rễ bình quân/chồi (rễ) = Tổng số chồi ra rễ Tổng chiều dài rễ Chiều dài trung bình rễ (cm) =
* Các chỉ tiêu đánh giá khả năng thích ứng cây ở vườn ươm:
Tổng số cây sống
Tỷ lệ sống (%) = x 100 Tổng số cây theo dõi
Tổng chiều cao cây Chiều cao TB cây (cm) =
Tổng số số cây sống
* Phương pháp xử lý số liệu kết quả nghiên cứu
Kết quả được xử lý thống kê phân tích phương sai một nhân tố bằng chương trình Microsoft Office Excel
PHẦN 4.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Ảnh hƣởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân chồi in vitro cây ba kích
Trong giai đoạn nhân nhanh in vitro, vai trò của chất kích thích sinh trưởng là rất quan trọng, cytokinin có vai trò kích thích sự phân chia tế bào, ảnh hưởng đến sự biệt hóa, đặc biệt là sự phân hóa chồi, kích thích sự nảy mầm chồi ngủ, kích thích sự sinh trưởng của chồi bên và loại bỏ ưu thế ngọn. BAP là loại cytokinin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật. BAP có tác dụng tích cực trong việc kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian sinh trưởng của mô phân sinh và làm hạn chế sự già hoá của tế bào.Trong nhân giống in vitro, BAP có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc kích thích mạnh mẽ sự hình thành chồi non, quyết định hệ số nhân và chất lượng chồi hình thành.
Trong nhân giống cây in vitro để được hệ số nhân giống cao với số lượng nhiều, đồng nhất có sức sinh trưởng tốt thì việc xác định môi trường nhân nhanh có vai trò quyết định đến việc thành công trong quá trình này. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ BAP ở các nồng độ 0,0, 1,0, 2,0 và 3,0 mg/l trong môi trường cơ bản MS nhằm đánh giá khả năng nhân chồi ba kích in vitro. Các chồi ba kích in vitro được cắt thành đoạn có chiều dài 2,5 cm mang 2 cặp lá được sử dụng để làm mẫu cấy cho thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP (6 benzyl aminopurin) tới khả năng nhân nhanh chồi ba kích. Mẫu được cấy vào các bình môi trường theo các công thức thí nghiệm khác nhau về nồng độ BAP.
Kết quả nghiên cứu sau sáu tuần thí nghiệm (Phụ lục 2) được trình bày tóm tắt trong bảng 4.1.
Qua bảng 4.1 cho thấy tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt 100% ở cả 4 công thức thí nghiệm, số chồi /mẫu dao động từ 2,11 (NC1) tới 5,67 (NC3), số lá /chồi dao động từ 2,76 (NC41) tới 3,34 (NC1), chiều cao trung bình chồi dao động từ 2,80 cm (NC1) đến 3,23 cm (NC4). Qua số liệu trên ta nhận thấy các công thức có bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau ảnh hưởng khác nhau tới khả năng nhân nhanh chồi ba kích in vitro thể hiện ở các chỉ tiêu nghiên cứu như số chồi trung bình/mẫu, số lá trung bình/chồi, chiều cao trung bình chồi của mẫu cấy.
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của một số nồng độ BAP tới khả năng nhân nhanh chồi cây ba kích in vitro
STT Công thức thí nghiệm Nồng độ BAP (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi/mẫu (chồi) Số lá/chồi (lá) Chiều cao TB chồi (cm) 1 NC1 0,0 100,00 2,11 c 3,34 a 2,80 b 2 NC2 1,0 100,00 3,97 b 2,90 b 3,06 ab 3 NC3 2,0 100,00 5,67 a 2,80 bc 3,16 a 4 NC4 3,0 100,00 5,27 a 2,76 c 3,23 a LSD0.05 0,52 0,16 0,23
(Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê p <0,05)
Kết quả phân tích phương sai một nhân tố (Phụ lục 2) về từng chỉ tiêu số chồi trung bình/mẫu, số lá trung bình/chồi, chiều cao trung bình chồi ở các công thức thí nghiệm khác nhau đều cho kết luận rằng các công thức thí nghiệm khác nhau có ảnh hưởng khác nhau tới các chỉ tiêu nghiên cứu.
Kết quả theo dõi về số chồi/mẫu ở các công thức thí nghiệm khác nhau về nồng độ BAP được thể hiện ở bảng 4.1 và minh họa ở hình 4.1. Qua đó, ta thấy, nồng độ BAP càng tăng thì số chồi/mẫu cấy cũng tăng. Ở công thức NC1 (không bổ sung BAP) thu được 2,11 chồi/mẫu; NC2 (bổ sung 1,0 mg/l BAP) thu được 3,97 chồi/mẫu; NC3 (bổ sung 2,0 mg/l BAP) thu được 5,67 chồi/mẫu đạt giá trị cao nhất; NC4 (bổ sung 3,0 mg/l BAP) thu được 5,27 chồi/mẫu.
Phân tích thống kê ở độ tin cậy 95% về ảnh hưởng của nồng độ BAP tới chỉ tiêu số chồi trung bình ở mỗi mâu cấy (Phụ lục 2) cho thấy các công thức thí nghiệm có ảnh hưởng khác nhau tới chỉ tiêu nghiên cứu. Công thức thí nghiệm NC3 (2,0mg/l) và NC4 (3,0 mg/l) được xếp chung một nhóm và có hiệu quả ảnh hưởng tốt nhất tới số chồi trung bình/mẫu với giá trị đạt được lần lượt là 5,67 chồi/mẫu và 5,27 chồi/mẫu. Công thức thí nghiệm NC1 (không bổ sung BAP) cho kết quả số chồi/mẫu thấp nhất (2,11 chồi/mẫu). Công thức thí nghiệm NC2 (1,0 mg/l) cho kết quả đạt 3,97 chồi/mẫu. Như vậy, ta có thể đưa ra nhận định rằng môi trường MS có bổ sung BAP với nồng độ 2,0mg/l (NC3) hoặc 3,0 mg/l (NC4) có ảnh hưởng tốt nhất tới số chồi/mẫu khi nhân nhanh chồi ba kích in vitro từ đoạn thân.
Phân tích thống kê ở độ tin cậy 95% về ảnh hưởng của nồng độ BAP tới chỉ tiêu số lá trung bình trên chồi (Phụ lục 2) cho thấy các công thức thí nghiệm có ảnh hưởng khác nhau tới chỉ tiêu nghiên cứu. Ở môi trường nuôi cấy không bổ sung BAP số lá trung bình/chồi đạt giá trị cao nhất (đạt 3,34 lá/chồi) và được xếp thành một nhóm riêng. Số lá trung bình trên chồi của các mẫu cấy ở các công thức NC2 (1,0 mg/l) và NC3 (2,0mg/l) đạt giá trị lần lượt là 2,90 chồi/mẫu và 2,80 chồi/mẫu. Ở môi trường nuôi cấy có bổ sung 3,0 mg/l BAP các mẫu cấy có số lá/chồi thấp nhất (2,76 lá/chồi). Như vậy, ta có thể đưa ra nhận định rằng môi trường MS không bổ sung BAP (NC1) có ảnh hưởng tốt nhất tới số lá/chồi khi nhân nhanh chồi ba kích in vitro từ đoạn thân. Kết quả này có thể giải thích như sau, trong các công thức thí nghiệm, môi trường NC1 (không bổ sung BAP) có số lượng chồi/mẫu cấy đạt giá trị thấp nhất, vì thế trên một mẫu cấy chỉ có ít chồi nên tốc độ phát triển của chồi nhanh hơn so với các công thức thí nghiệm cho giá trị số chồi/mẫu cấy lớn hơn.
Phân tích thống kê ở độ tin cậy 95% về ảnh hưởng của nồng độ BAP tới chỉ tiêu chiều cao bình bình chồi ở mỗi mẫu cấy (Phụ lục 2) cho thấy các công thức thí nghiệm có ảnh hưởng khác nhau tới chỉ tiêu nghiên cứu. Công thức thí nghiệm NC3 (2,0mg/l) và NC4 (3,0 mg/l) được xếp chung một nhóm và có hiệu quả ảnh hưởng tốt nhất tới chiều cao trung bình chồi ở mỗi mẫu cấy với giá trị đạt được lần lượt là 3,16cm và 3,23cm. Công thức thí nghiệm NC1 (không bổ sung BAP) cho kết quả chiều cao trung bình chồi là thấp nhất (2,80cm). Công thức thí nghiệm NC2 (1,0mg/l) cho kết quả đạt 3,06cm. Như vậy, ta có thể đưa ra nhận định rằng môi trường MS có
bổ sung BAP với nồng độ 2,0 mg/l (NC3) hoặc 3,0 mg/l (NC4) có ảnh hưởng tốt nhất tới chiều cao trung bình chồi của mẫu cấy cây ba kích in vitro.
Với kết quả ở bảng 4.1 cho thấy, trong các công thức thí nghiệm, khi nồng độ BAP tăng sẽ ảnh hưởng tốt hơn tới số chồi/mẫu cấy và chiều dài trung bình của chồi dài nhất.
Vậy, kết quả nghiên cứu trên cho thấy nồng độ BAP có ảnh hưởng lớn đến quá trình phát sinh chồi từ các chồi nách, công thức thí nghiệm NC3 và NC4 có thành phần môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l và 3,0mg/l BAP có ảnh hưởng tốt tương đương nhau tới khả năng nhân nhanh chồi ba kích về hai chỉ tiêu số chồi trung bình/mẫu (đạt 5,67 và 5,27 chồi/mẫu), chiều cao trung bình chồi (đạt 3,16 và 3,23 cm)
Trong nghiên cứu này, số chồi trung bình/mẫu cao nhất ở công thức NC3 và NC4 (5,67 và 5,27 chồi/mẫu) là thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của tác giả Hoàng Thị Thế (2013) - môi trường MS bổ sung 3mg/l BAP, 0,2mg/l IBA và 10mg/l Riboflavin thích hợp nhân chồi ba kích, đạt 10,13 chồi/mẫu [14[ và thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của tác giả Võ Châu Tuấn (2010) - môi trường MS bổ sung 3,5 mg/l BAP, 0,2mg/l IBA và 10mg/l Riboflavin thích hợp nhân chồi ba kích, đạt 10,13 chồi/mẫu. [12]
Để nghiên cứu về khả năng nhân nhanh chồi Ba Kích cần tiến hành thêm các nghiên cứu để xác định số lần cấy chuyển nhằm tăng hiệu quả nhân chồi, để tìm ra được nồng độ BAP tốt nhất đến khả năng nhân nhanh của chồi cây Ba Kích tím cần phải tiến hành thêm thí nghiêm khác ở các nồng độ khác nhau. Tuy nhiên, trong khuôn khổ đề tài này, thời gian có hạn chúng tôi chưa tiến hành được thử nghiệm ở các nồng độ khác và về số lần cấy chuyển.
4.2. Ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của cây Ba Kích.
Trong quá trình nuôi cấy in vitro, một số rất ít các chồi có thể hình thành rễ ngay trên môi trường MS không cần bổ sung chất kích thích sinh trưởng, hầu hết đều chưa có rễ. để cây thích nghi với điều kiện tự nhiên bên ngoài được thuận lợi người ta sử dụng các biện pháp kích thích cho chồi ra rễ. Một số nghiên cứu cho thấy rằng đối với một số loài cây “khó” ra rễ invitro hoặc “lâu” hình thành rễ trên môi trường MS thì nền môi trường giảm đi một nửa (½ MS) sẽ kích thích hình thành rễ nhanh hơn. Nghiên cứu của Võ Châu Tuấn, Huỳnh Minh Tư (2010) trên cây ba kích cho thấy môi trường MS + 0,2 - 0,25 mg/l IBA cho tỷ lệ ra rễ 100% sau 30 ngày.
Qua tham khảo tài liệu, nhằm tìm ra được môi trường kích thích ra rễ nhanh hơn, tốt hơn cho cây ba kích, tôi đã tiến hành các thí nghiệm về ảnh hưởng của IBA đến sự hình thành rễ cũng như chất lượng của bộ rễ. IBA cũng là loại auxin thường được sử dụng để kích thích phản ứng tạo rễ bất định cho chồi. Chính vì vậy, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến sự hình thành rễ của chồi ba kích. Để tìm