2.4.1. Ứng dụng kỹ thuật laser trong nghiên cứu sinh học tế bào
Trong công nghệ sinh học tế bào, vi tia laser và kìm gắp quang học được ứng dụng rộng rãi bởi nó có nhiều ưu việt so với những dụng cụ siêu nhỏ hoạt động theo nguyên lý cơ học. Tất nhiên, vi tia laser là công cụ không gì sánh được khi ta muốn đi sâu nghiên cứu vào trong
tế bào mà không phải mở tế bào ra, nghĩa là không làm tổn thương tế bào. Dựa vào tính chất biến đổi bước sóng, mỗi laser đều có thể điều chỉnh tần số trong một miền nhất định. Vì luôn phải tìm bước sóng laser phù hợp đối với một tế bào sinh học ít nhiều trong suốt nên ta có thể điều chỉnh tia laser chiếu vào tế bào. Nếu thay đổi điểm hội tụ trong tế bào, ta có thể làm dịch chuyển siêu cấu trúc tế bào. Cũng có thể kết hợp khả năng này với vi tia laser chiếu vào trong tế bào để cắt hay khoan tế bào, và nhờ tia đó đã mở ra một lĩnh vực ứng dụng mới cho tới nay vẫn khó hình dung nỗi đối với vi phẩu
thuật tế bào [3].
Kỹ thuật Flow cytometry: là kỹ thuật đếm và phân loại tế bào, là kỹ thuật cho phép phân lọai tế bào (tế bào riêng rẽ) khác nhau dựa trên các đặc điểm khác nhau của chúng, việc xác định dựa trên cơ sở cách chúng di chuyển trong một dòng dung dịch. Thiết bị sử dụng trong kỹ thuật này cho phép thu thập các thông tin về tế bào thông qua dạng tế bào, sự phát xạ huỳnh quang, cho phép sắp xếp tế bào dựa trên cơ sở đặc
tính vật lý, hóa học và đặc tính của kháng nguyên.
Thiết bị Flow cytometer, đôi khi còn gọi là Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), có một số thành phần chính: 1. Một nguồn sáng hoặc nguồn xạ gây kích thích, là 1 dạng laser có thể phát ra ánh sáng ở một bước sóng xác định.
2. Một ống dẫn, cho phép huyền phù tế bào di chuyển qua thiết bị và nguồn laser. 3. Đầu dò, trong trường hợp đang trình bày là ống photomultiplier, cho phép đo ánh sáng vừa lóe lên của tế bào khi chúng di chuyển qua chùm tia laser.
Trong thiết bị Flow cytometer, các tế bào di chuyển ngang qua nguồn kích thích, tia sáng khi va vào tế bào, chúng sẽ
bị tán xạ hoặc hấp thu và phát ra một ánh sáng huỳnh quang, hiện tượng trên
Hình 2.10.Thiết bị Flow cytometer
[7.(d)]
Hình 2.11. Quá trình phân loại tế bào
sẽ được ghi nhận bởi đầu dò ánh sáng.
Ánh sáng tán xạ là hệ quả khi một chùm sáng va chạm vào tế bào dẫn đến chúng phản xạ hoặc khúc xạ đến đầu dò ánh sáng. Các dạng sáng tán xạ phụ thuộc và hình dạng và kích thước của tế bào, cho phép đo đạc các đặc tính của những tế bào này khi chúng di chuyển qua nguồn sáng. Điều này khá hữu ích, các tế bào có thể được phân lọai dựa trên cơ sở kích thước và hình dạng trong các ống thu hồi riêng biệt sử dụng kỹ thuật được gọi là sự chênh lệch tĩnh điện, được áp dụng trên các đĩa tích điện dùng để đổi hướng di chuyển của tế bào.
Ánh sáng huỳnh quang: Việc xác định ánh sáng huỳnh quang phụ thuộc và khả năng hấp thu ánh sáng của tế bào và tiếp đến là khả năng phát xạ nguồn sáng này ở các bước sóng khác nhau. Flow cytometers ứng dụng tính chất này thông qua việc sử dụng kính lọc để ngăn nguồn sáng ban đầu không cho chúng di vào đầu dò, trong khi ánh sáng hùynh quang do sự phát xạ có thể di chuyển tự do vào đầu dò ánh sáng, do vậy tính hiệu nền (nhiễu) rất thấp. Khi thí nghiệm với flow cytometry, ánh sáng huỳnh quang thu đuợc từ sự phát sáng của các chất chỉ thị (thuốc nhuộm) hùynh quang. Thuốc nhuộm huỳnh quang chỉ phát sáng thứ cấp với những nguồn kích thích có bước sóng xác định. Ánh sáng thứ cấp (huỳnh quang) phát ra sẽ được dùng để xác định sự hiện diện của thuốc nhuộm có trong tế bào.
Cách biểu diễn dữ liệu phân tích: Số luợng của một lọai tế bào gây tán xạ hoặc phát hùynh quang sẽ được đo bằng đầu dò. Đặc tính của các dạng tế bào thường được biểu diễn dạng Dot plot hoặc dạng biểu đồ.
Dạng Dot plot sử dụng 2 thông số để vẽ khung dữ liệu tổng quát trong qúa trình phân tích dòng chảy.
Mỗi điểm thể hiện sự di chuyển của 1 tế bào khi nó đi qua đầu dò (Hình 2.12). Trục X và Y đo các mức độ phát sáng khác nhau, 1 điểm biểu thị tương ứng với 1 tế bào có dạng phát sáng khác nhau. Trong hình 2.12, các điểm chấm là một ví dụ biểu diễn hai quần
thể tế bào đã được phân tích bằng phương pháp flow cytometry. Mỗi tế bào trong một dạng quần thể xác định được hiển thị dạng điểm chấm nằm trong ¼ của khung được thiết kế cho quần thể đó.
Kết quả phân tích flow cytometry cũng được biểu hiễn dưới dạng biểu đồ như hình 2.13: trục X biễu diễn tín hiệu thu được, trục Y biểu diễn số lượng các tế bào. Đồ thị thường dùng để biểu diễn 2 hoặc nhiều mẫu cùng sử dụng 1 lọai thuốc nhuộm. Trong thí nghiệm xác định sự hiện diện hoặc vắng mặt của chất đánh dấu hoặc sự tăng hay giảm của chất đánh dấu sau khi xử lý, đồ thị sẽ biểu diễn mật độ phát sáng của các tế bào được phân tích [7.(d)].
2.4.2. Ứng dụng laser làm lạnh nguyên tử
Làm lạnh nguyên tử hay làm đông đặc hệ nguyên tử là ứng dụng hiện đại nhất của laser, trong đó laser bước sóng thay đổi đóng vai trò hết sức quan
Hình 2.12. Dạng Dot plot [7.(d)]
Hình 2.13. Dạng biểu đồ [7.(d)]
Y
trọng trong suốt quá trình. Mục đích của việc tạo ra một hệ đậm đặc các nguyên tử là để quan sát một cách tốt hơn cấu trúc vật chất ở mức độ nguyên tử. Từ đó có thể tăng độ chính xác trong các phép đo cơ bản đối với các đại lượng vật lý trong tự nhiên. Một trong những phương pháp làm lạnh hệ nguyên tử là làm lạnh bằng laser. Trong quá trình làm lạnh, ta phải hiệu chỉnh bước sóng phát của laser thay đổi phù hợp với tần số cộng hưởng và phù hợp với tốc độ giảm dần của các nguyên tử hoạt tính. Các laser bước sóng thay đổi như: laser màu, laser Vibrronic thường được dùng trong kỹ thuật làm lạnh nguyên tử.
Để làm lạnh nguyên tử, tức là làm chậm tốc độ chuyển động của chúng trong một thể tích nhất định với một xung lượng tương đương với xung lượng của nguyên tử, ta có thể sử dụng một chùm tia laser với n photon xung lượng
k chiếu vào nguyên tử ngược chiều chuyển động của nó.
Bình chứa các nguyên tử hoạt tính chuyển động hỗn loạn với vận tốc phụ thuộc nhiệt độ T. Bình này được đặt trong một hệ chân không. Khoan một lỗ nhỏ ở thành bình và các nguyên tử sẽ ra khỏi bình theo lỗ này. Nếu ta đặt các lỗ nhỏ liên tục trên hướng chuyển động của các nguyên tử thì ta sẽ được chùm nguyên tử chuyển động theo một hướng với vận tốc như nhau, đều phụ thuộc nhiệt độ trong bình. Ngược chiều với chùm nguyên tử, ta đặt một laser thay đổi bước sóng công suất lớn. Laser này sẽ hạn chế tốc độ
“Bẫy” từ trường tuyến tính B(z) = A.z
chuyển động của chúng trong cái gọi là “bẫy” từ trường tuyến tính.
Thực tế, chúng ta phải làm lạnh nguyên tử trong một thể tích nhất định. Do đó, quá trình làm lạnh phải theo không gian ba chiều. Ngoài ra, sau khi làm chậm được các nguyên tử thì quá trình giam “bẫy” chúng cũng rất là quan trọng [1].
Lịch sử của thành tựu khoa học này gắn liền với tên của một nhà bác học rất nổi tiếng. Trong một công trình công bố vào năm 1917, Anhxtanh đã cho thấy: một chất khí ở dạng phân tử, trong một trường ánh sáng nhiệt do bức xạ của một đèn dây tóc tạo ra sẽ chấp nhận nhiệt độ của trường đó. Nguyên nhân bởi các photon ánh sáng khi va chạm với một phân tử sẽ không những truyền năng lượng, mà còn truyền cả xung lượng, thông qua áp suất bức xạ này mà thay đổi vận tốc của đối tác va chạm. Bởi vậy, ánh sáng nhiệt gắn liền với một nhiệt độ cao, bằng vài nghìn độ K sẽ không thích hợp với việc làm lạnh. Điều kiện đã thay đổi một cách rõ rệt khi người ta phát minh ra được laser – một nguồn sáng tuyệt đối đơn sắc, bước sóng thay đổi được. Lúc này, laser bước sóng thay đổi được dùng để thay cho đèn dây tóc [3].
Vào năm 1975, các nhà khoa học đã nghĩ đến phương pháp làm lạnh hết sức hiệu dụng cho các nguyên tử trung hòa: các hạt của một chất khí khi ở nhiệt dộ phòng sẽ bay hỗn loạn với vận tốc vài ngàn km/h, sẽ được chiếu sáng theo hai phương ngược nhau bởi hai tia laser có tần số thấp hơn tần số hấp thụ của các hạt chất khí một chút. Những nguyên tử chuyển động ngược với một trong hai tia, sau đó sẽ cộng hưởng với nó qua hiệu ứng Doppler và sẽ hấp thụ photon. Khi đó chúng tiếp nhận xung lượng của các photon rối bị hãm lại. Tuy rằng sau đó chúng cũng cho đi các photon mà chúng đã tiếp nhận.
Phương pháp làm lạnh Doppler là một phương pháp được dùng để bẫy và làm lạnh nguyên tử hoặc ion. Phương
pháp làm lạnh Doppler là một trong các phương pháp làm lạnh phổ biến bằng laser. Phương pháp làm lạnh này đã được đưa ra bởi Theodor W. Hänsch và Arthur Leonard Schawlow ở Đại học Stanford năm 1975 và được thí nghiệm thành công bởi Steven Chu ở Phòng thí nghiệm AT&T Bell vào năm 1985. Khi các nguyên tử hoặc ion đã được bẫy trong bẫy ion thì ta dùng các laser để chiếu photon theo nhiều chiều. Khi
nguyên tử chuyển động ngược chiều với chiều chiếu photon, nguyên tử sẽ chuyển động chậm đi, vì thế nhiệt độ nguyên tử cũng giảm.
Mô tảnguyên lý làm lạnh bằng phương pháp Doppler:
1 Nguyên tử đứng yên sẽ thấy photon có bước sóng không phải đỏ hoặc xanh dương nên sẽ không hấp thụ photon.
2 Nguyên tử chuyển động cùng chiều chiếu photon sẽ thấy photon có bước sóng của ánh sáng đỏ nên sẽ không hấp thụ.
3.1Nguyển tử chuyển động ngược chiều chiếu photon nên sẽ thấy photon có bước sóng của ánh sáng xanh dương nên sẽ hấp thụ photon, đồng thời làm giảm momen động lượng của nguyên tử.
3.2Nguyên tử bị kích thích bởi photon sẽ chuyển sang trạng thái kích thích (có mức năng lượng cao hơn ban đầu).
3.3Nguyên tử giải phóng photon theo một chiều ngẫu nhiên. Và momen động
Hình 2.15. Nguyên lý làm lạnh
bằng phương pháp Doppler [7.
lượng của nguyên tử sẽ giảm trong hầu hết các trường hợp.
Khi chiếu chùm photon có bước sóng nhất định về phía một nguyên tử đang chuyển động ngược chiều, do hiệu ứng Doppler nguyên tử sẽ thấy photon có bước sóng dịch chuyển xanh. Nếu bước sóng này phù hợp, nguyên tử có thể hấp thụ photon và chuyển sang trạng thái kích thích trong một khoảng thời gian ngắn. Khi hấp thụ photon, nguyên tử nhận cả momen động lượng của photon đó nên sẽ chuyển động chậm lại, vì chiều chuyển động của photon và nguyên tử ngược chiều nhau.
Do trạng thái kích thích không bền, nguyên tử sẽ giải phóng photon theo một hướng bất kỳ, đồng thời chuyển về mức năng lượng thấp hơn. Nếu photon phát ra theo hướng photon ban đầu thì nguyên tử càng mất momen động lượng. Còn nếu photon phát ra theo hướng ngược lại thì momen động lượng của nguyên tử tăng. Nhưng thường thì photon sẽ được phát ra theo nhiều hướng khác nên momen động lượng của nguyên tử vẫn giảm.
Sự thay đổi tốc độ của nguyên tử khi hấp thụ photon có thể tính theo công thức: m p đó do m p p p= photon =∆ ∆ = photon ∆ υ υ υ υ
Nếu nguyên tử chuyển động cùng chiều với chiều chiếu photon, theo hiệu ứng Doppler, nguyên tử sẽ thấy photon bị dịch chuyển đỏ, lệch khỏi bước sóng thích hợp và nguyên tử sẽ không thể hấp thụ photon.
Khi các nguyên tử được bẫy trong bẫy ion và được chiếu laser theo nhiều chiều với tần số thích hợp, các nguyên tử sẽ liên tục hấp thụ và giải phóng photon, vì thế momen động lượng của nguyên tử sẽ giảm dần gần về 0. Khi đó các nguyên tử đã được làm lạnh.
Phương pháp làm lạnh Doppler được dùng rộng rãi trong phương pháp làm lạnh bằng laser, đặc biệt kết hợp với những phương pháp làm lạnh khác để tạo được hiệu suất làm lạnh tối ưu, làm lạnh vật thể lớn gần nhiệt độ 0 tuyệt đối [7.(b)].
Ngay từ năm 1988, Phillips và các cộng sự của ông đã xây dựng được phương pháp chính xác hơn để xác định nhiệt độ ở các xirô quang học. Họ đã làm giới khoa học phải ngạc nhiên về những trị số rõ rang nằm dưới cả giới hạn Doppler. Năm 1989, Dalibard và Cohen-Tannougji cũng như Chu và các cộng sự đã giải thích được kết quả của thí nghiệm bất ngờ đó: người ta đã không để ý đến chứng cớ hiển nhiên là trạng thái điện tử cơ bản của những nguyên tử kiềm đã dùng là suy biến, nghĩa là nó gồm nhiều mức con có cùng năng lượng. Các mức này khi tương tác với ánh sáng phân cực của chúng mà sẽ bị dịch chuyển theo các mức năng lượng khác nhau. Đồng thời các mức này cũng được phân bố khác nhau tùy thuộc sự phân cực của ánh sáng. Ta có thể hình dung như sau: Khi chuyển động, các nguyên tử trèo lên một mức thế năng cao hơn, ở đó chúng lại hấp thụ một photon rồi bức xạ một photon có năng lượng lớn hơn photon mà chúng vừa hấp thụ, vì thế chúng bị rơi về mức thế năng thấp hơn. Phần năng lượng mà các nguyên tử đã dùng để trèo lên mức thế năng cao đã được chuyển thành quang năng và mang đi theo các photon. Điều này cứ lặp đi lặp lại mãi cho tới khi hạt quá chậm để có thể trèo lên múc thế năng cao hơn. Cơ chế làm lạnh như thế được gọi là cơ chế làm
lạnh Sisyphus [3].
Trong một loạt thí nghiệm với nguyên tử Hêli, năm 1984 và sau đó năm 1995, các nhà khoa học đã đạt tới trước tiên là trên một phương, rồi
Hình 2.16. Dùng tia laser làm lạnh khí [7. (e)]
sau cả hai và ba phương, những nhiệt độ rõ ràng thấp hơn cả giới hạn phản hồi. Hiện nay đã có thêm những phương pháp mới, đặc biệt là phương pháp làm lạnh Raman do Marc Kasevich và Chu phát biểu lần đầu tiên vào năm 1992 [3].
Các nhà nghiên cứu Đức vừa phát minh ra phương pháp làm lạnh khí áp suất cao đạt tới hơn 100 độ dưới độ không chỉ trong vài phút. Bằng việc bắn phá khí áp suất cao bằng một tia laser, các nhà nghiên cứu đã có thể tạo ra hiệu ứng lạnh cực mạnh, làm giảm nhiệt độ của khí này tới -119 độ hầu như ngay tức thì bằng cách đưa các electron vào một quỹ đạo cao hơn.
Điều khiển các tuyến đường của electron không phải là một nhiệm vụ nhỏ, nhưng các nhà nghiên cứu có thể đơn giản hóa quy trình này đáng kể bằng cách sử dụng khí áp suất cao. Áp suất khiến cho các electron hoạt động không ổn định do các nguyên tử va vào nhau, làm lệch nhẹ hướng của chúng. Một khi chệch khỏi các tuyến đường thông thường của chúng, các electron sẽ bị buộc vào một quỹ đạo cao hơn với mức năng lượng ít hơn nhiều mức lẽ ra cần ở áp suất thấp. Khi các va chạm giảm xuống, các electron cố gắng trở lại tuyến đường thông thường của chúng, dẫu vẫn đang ở các quỹ đạo cao hơn mới. Để có thể vẫn ở quỹ đạo cao hơn này, chúng phải hấp thụ năng lượng xung quanh và quy trình này làm chậm các hạt khí xuống rất nhiều, gây ra