Để tuyển chọn được các chủng vi khuẩn axetic khác nhau, chúng tôi tiến
hành phân lập từ các nguồn nguyên liệu khác nhau: dịch hoa quả loãng, giấm. Trước tiên, cần chuẩn bị dịch lên men giấm và dịch hoa quả loãng. Cho vào bình tam giác hoặc bình cầu có dung tích 500 ml khoảng 200 ml giấm, hoặc dịch hoa quả, thêm vào đó một vài lát chuối tiêu đã bóc vỏ để cung cấp
thêm nguồn gluxit, vitamin cho vi khuẩn axetic phát triển. Đậy bằng nút bông,
cho vào tủ ấm nuôi ở 28oC – 32oC. Sau 5 – 7 ngày trên bề mặt thoáng của bình cầu sẽ xuất hiện lớp màng màu trắng, màng đó chính là tập hợp tế bào vi
khuẩn axetic có trong dịch lên men từ hai nguồn nguyên liệu trên (Hình 1,2).
Hình 2. Mẫu lên men dịch hoa quả loãng
Môi trường để phân lập vi khuẩn Acetobacter là môi trường 1 (thành
phần môi trường đã trình bày ở mục 2.3). Môi trường 1 (môi trường thạch đĩa) được khử trùng bằng nồi hấp cao áp Autoclave ở áp suất 0,5 atm, nhiệt độ 110oC, hấp 3 lần trong 3 ngày liên tiếp. Nguyên tắc của phương pháp khử trùng bằng nồi cao áp: là sự kết hợp giữa tác động của áp lực và nhiệt độ cao để tiêu diệt vi sinh vật (kể cả các nội bào tử chịu nhiệt của vi khuẩn).Trong nồi hấp cao áp, môi trường bị làm nóng bằng hơi nước bão hòa, áp suất trong nồi được tạo ra bởi áp suất của hơi nước. Khi áp suất ở đồng hồ áp kế chỉ khoảng 0,2 atm, dùng van xả hết hơi trong nồi cho đến khi kim áp suất chỉ về số 0 (để loại hết không khí còn sót lại trong nồi). Đóng van lại và đưa áp suất đến mức cần thiết, giữ đủ theo thời gian yêu cầu. Ở lần hấp cuối cùng bổ sung rượu etylic và axit axetic Sau khi thanh trùng cần để vào tủ ấm 24h – 28h để kiểm tra độ vô trùng của môi trường.
Để phân lập được chủng vi khuẩn Acetobacter ta dùng que cấy hoặc đũa
thủy tinh sạch lấy một lượng màng nhất định cho vào nước vô trùng. Dùng que cấy hoặc đũa thủy tinh đánh tan đều hay lấy ngay dịch lên men bằng pipet vô trùng, tiếp theo tiến hành pha loãng (theo phương pháp pha loãng của Pasteur) ở các độ pha loãng khác nhau: 10 -1; 10 -2; 10 -3; …; 10 -9; 10 -10. Sau đó nhỏ một giọt dung dịch pha loãng ở các nồng độ từ 10 -7 đến 10 -10 lên môi trường thạch đĩa (môi trường số 1 đổ trong hộp petri). Dùng bàn trang thủy tinh vô trùng dàn đều giọt dịch khắp bề mặt thạch để tách riêng rẽ các tế bào vi sinh vật. Cho các hộp petri trên vào tủ ấm, nuôi ở nhiệt độ 30oC. Sau 4 – 6 ngày, trên bề mặt thạch đĩa xuất hiện những khuẩn lạc to nhỏ khác nhau, có đường kính 0,8 – 2,5 mm (đôi khi xuất hiện những khuẩn lạc lớn có đường kính tới 4 – 5 mm) bề mặt trơn bóng, phần giữa lồi lên dày hơn và màu sẫm hơn xung quanh, cũng có dạng bề mặt xù xì, khô, mép khuẩn lạc nhăn nheo.
Sau khi đã có các khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa, dựa vào đặc
điểm của khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter trên môi trường thạch đĩa (đã nêu ở
trên) chúng tôi chọn những khuẩn lạc riêng rẽ, kích thước lớn, tròn, bề mặt trơn bóng dùng que cấy đầu tròn đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn gợt lấy từng khuẩn lạc, mỗi khuẩn lạc được cấy trên một ống thạch nghiêng, mỗi ống là một mẫu vi khuẩn được mã hóa bằng các kí hiệu khác nhau.
Từ dịch lên men giấm, sau một thời gian phân lập, chúng tôi thu được 30 mẫu khuẩn lạc. Các mẫu này có đường kính 0,8 – 2 mm, bề mặt trơn bóng, phần giữa lồi và có màu sẫm hơn (Hình 3). Từ 30 mẫu khuẩn lạc này cấy ra 30 ống thạch nghiêng có kí hiệu từ G1 đến G30.
Hình 3. Khuẩn lạc phân lập từ giấm
Từ dịch lên men dịch hoa quả loãng chúng tôi thu được 27 mẫu khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa. Tôi nhận thấy các khuẩn lạc phân lập được từ dịch hoa quả ngoài những khuẩn lạc có bề mặt trơn bóng, phần giữa lồi có màu sẫm hơn lớn, còn xuất hiện những khuẩn lạc không có màu, mỏng như những hạt sương nhỏ, bề mặt trơn bóng, dễ dàng dùng que cấy gạt ra khỏi môi trường (Hình 4). Từ 27 mẫu khuẩn lạc trên đem cấy ra 27 ống thạch nghiêng được kí hiệu từ D1 đến D27.
Hình 3. Khuẩn lạc phân lập từ dịch hoa quả
Kết quả: đã phân lập và thu được 57 mẫu vi khuẩn axetic từ hai nguồn
nguyên liệu là giấm và dịch hoa quả loãng.. Những mẫu vi khuẩn phân lập được ở trên được giữ trong ống thạch nghiêng, cấy chuyển từ ống thạch nghiêng này sang ống thạch nghiêng khác với chu kì 2 tháng một lần để tránh thoái hóa giống.
Từ những mẫu vi khuẩn axetic thu được ở trên chúng tôi tiến hành tuyển chọn ra những mẫu vi khuẩn Acetobacter thuần khiết và có khả năng tạo màng
dai trên môi trường nuôi cấy dịch thể.
3.2. Tuyển chọn mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng, dai trên môi trường nước dừa
Khi đã có các mẫu vi khuẩn axetic phân lập được từ hai nguồn nguyên
liệu trên cần tiến hành thử khả năng lên màng của các mẫu trong môi trường dịch thể là nước dừa để tuyển chọn ra những mẫu có khả năng tạo màng dai.
Tiến hành nuôi cấy 57 mẫu vi khuẩn thu được ở trên trên môi trường nước dừa theo dõi, quan sát khả năng tạo màng, màu của dịch nuôi cấy. Kết quả thu được sau 15 – 18 ngày nuôi cấy được dẫn ra ở bảng sau:
Bảng 3.1. Khảo sát khả năng tạo màng của các mẫu vi khuẩn axetic.
STT Kí hiệu mẫu
Khả năng tạo màng Môi trường nuôi cấy Màng tan Màng dai Đục Trong 1 Axetic G1 + _ + _ 2 Axetic G2 + _ + _ 3 Axetic G3 _ + _ + 4 Axetic G4 _ + + _ 5 Axetic G5 _ + _ + 6 Axetic G6 + _ + _ 7 Axetic G7 + _ + _ 8 Axetic G8 + _ + _ 9 Axetic G9 + _ + _ 10 Axetic G10 _ + _ + 11 Axetic G11 _ + + _ 12 Axetic G12 + _ + _ 13 Axetic G13 + _ _ + 14 Axetic G14 + _ _ + 15 Axetic G15 + _ _ + 16 Axetic G16 + _ + _ 17 Axetic G17 _ + + _ 18 Axetic G18 + _ + _ 19 Axetic G19 + _ + _ 20 Axetic G20 + _ + _
21 Axetic G21 + _ + _ 22 Axetic G22 + _ _ + 23 Axetic G23 + _ _ + 24 Axetic G24 _ + _ + 25 Axetic G25 _ + + _ 26 Axetic G26 _ + + _ 27 Axetic G27 + _ _ + 28 Axetic G28 + _ _ + 29 Axetic G29 + _ _ + 30 Axetic G30 + _ + _ 31 Axetic D1 + _ _ + 32 Axetic D2 + _ _ + 33 Axetic D3 + _ + _ 34 Axetic D4 + _ + _ 35 Axetic D5 _ + _ + 36 Axetic D6 + _ _ + Axetic D7 + _ _ + 38 Axetic D8 + _ _ + 39 Axetic D9 + _ + _ 40 Axetic D10 _ + + _ 41 Axetic D11 _ + + _ 42 Axetic D12 + _ + _ 43 Axetic D13 + _ + _ 44 Axetic D14 + _ _ + 45 Axetic D15 + _ + _ 46 Axetic D16 + _ _ +
47 Axetic D17 + _ _ + 48 Axetic D18 _ + + _ 49 Axetic D19 _ + _ + 50 Axetic D20 _ + _ + 51 Axetic D21 + _ + _ 52 Axetic D22 + _ _ + 53 Axetic D23 + _ + _ 54 Axetic D24 + _ + _ 55 Axetic D25 + _ _ + 56 Axetic D26 + _ _ + 57 Axetic D27 _ + + _ Ghi chú: (+) : có. (-) : không.
Qua kết quả được dẫn ra ở bảng trên ta thấy có 41 mẫu vi khuẩn axetic tạo màng tan, 16 mẫu vi khuẩn axetic cho màng dai với độ dày mỏng khác
nhau. Chúng chia thành 4 loại:
+ Loại thứ nhất: các mẫu vi khuẩn axetic cho màng dai, dịch nuôi cấy
trong.
+ Loại thứ hai: các mẫu cho màng dai, dịch nuôi cấy đục. + Loại thứ ba: cho màng tan, dịch nuôi cấy trong.
+ Loại thứ tư: cho màng tan, dịch nuôi cấy đục.
Chúng tôi giữ lại 16 chủng vi khuẩn axetic cho màng dai để tiếp tục tiến hành các thí nghiệm nhằm tuyển chọn ra những chủng vi khuẩn Acetobacter
Để xác định xem 16 mẫu vi khuẩn axetic cho màng dai trên là
Acetobacter hay Gluconobacter, tôi thử các mẫu trên trên môi trường A. Kết
quả thu được: Cả 16 mẫu đều tạo vòng sáng xung quanh khuẩn lạc và có một lớp cặn đục ở viền khuẩn lạc hướng về phía vòng sáng.
Dựa vào kết quả thí nghiệm chúng tôi khẳng định 16 mẫu vi khuẩn này
là vi khuẩn Acetobacter chứ không phải Gluconobacter. Như vậy chỉ có vi khuẩn Acetobacter mới có khả năng tạo màng dai còn Gluconobacter thì
không có khả năng này. Đồng thời tôi cũng khẳng định 16 mẫu này là vi
khuẩn Acetobacter xylinum vì khi nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum
trong môi trường lỏng chúng tạo thành màng ở trên bề mặt thoáng của dung dịch. Màng này là sản phẩm của quá trình trao đổi chất của vi khuẩn trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Màng xenluloza gồm những bó vi sợi xenluloza được đẩy ra ngoài nhờ nhệ thống lỗ nằm trên màng tế bào của tế bào vi khuẩn
Acetobacter xylinum. Những dải xenluloza này bện vào nhau tạo thành màng.
Chất kiến tạo cơ bản của quá trình tổng hợp xenluloza là glucoza – là thành
phần chính của môi trường nuôi cấy Acetobacter xylinum.
Như vậy không phải tất cả các vi khuẩn Acetobacter đã chọn đều cho màng dai mà chỉ có vi khuẩn Acetobacter xylinum mới có khả năng tạo màng dai trên môi trường nước dừa. Từ 16 mẫu vi khuẩn Acetobacter này tôi tiến hành làm thí nghiệm tiếp nhằm tìm ra mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho
màng mỏng nhất.
Chúng tôi tiến hành tuyển chọn mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho
màng mỏng theo các tiêu chí sau: + Màng tạo ra mỏng, dai. + Bề mặt màng trơn.
Chúng tôi dùng 16 mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum tuyển chọn được
cấy sang môi trường lỏng (môi trường số 3, thay nước máy bằng nước dừa). Môi trường được khử trùng trong nồi hấp Autoclave ở áp suất 0,5 atm trong thời gian 30 phút, trong 3 ngày liên tiếp để nguội, bổ sung thêm rượu etylic, axit axetic 2%, cấy giống. Theo dõi khả năng tạo màng, độ dày màng, đặc điểm môi trường nuôi cấy.
Khi theo dõi quá trình hình thành màng của vi khuẩn trên môi trường số 3, chúng tôi thấy rằng đa số mẫu màng bắt đầu hình thành ở ngày thứ 7, thứ 8. Khoảng bốn ngày tiếp theo kể từ khi màng xuất hiện, màng dày lên rất nhanh, những ngày sau đó màng phát triển chậm dần. Màng có thể mỏng hoặc dày, trơn hoặc nhăn, khá dai, môi trường nuôi cấy trong hoặc đục. Kết quả thu được sau 15 ngày nuôi cấy như sau:
Bảng 3.2. Khảo sát khả năng tạo màng của một số mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum
STT Kí hiệu mẫu
Khả năng tạo màng Môi trường nuôi cấy
Mỏng Dày Đục Trong 1 Acetobacter xylinum G3 _ + _ + 2 Acetobacter xylinum G4 + _ + _ 3 Acetobacter xylinum G5 _ + + _ + 4 Acetobacter xylinum G10 _ + _ + 5 Acetobacter xylinum G11 + _ _ + 6 Acetobacter xylinum G17 _ ++ + _ 7 Acetobacter xylinum G24 _ ++ _ + 8 Acetobacter xylinum G25 _ + + _ 9 Acetobacter xylinum G26 _ + + + _ 10 Acetobacter xylinum D5 _ + _ +
11 Acetobacter xylinum D10 _ + + _ 12 Acetobacter xylinum D11 + _ + _ 13 Acetobacter xylinum D18 _ + + _ 14 Acetobacter xylinum D19 _ + _ + 15 Acetobacter xylinum D20 _ + _ + 16 Acetobacter xylinum D27 _ + + _ Ghi chú: Dấu (+) : có. Dấu (-) : không.
Dấu (+ +…) : màng dày tăng dần.
Qua theo dõi, quan sát quá trình hình thành màng và căn cứ vào độ dày của màng dai sau 15 ngày nuôi cấy, tôi nhận thấy 16 chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum trên đều có phát triển màng, chúng phổ biến ở 4 loại:
Loại thứ nhất: Cho màng mỏng (≤ 1cm), dịch nuôi cấy trong. Loại thứ hai: Cho màng mỏng, dịch nuôi cấy đục.
Loại thứ ba: Cho màng dày (≥ 2 cm) dịch nuôi cấy trong. Loại thứ tư: Cho màng dày, dịch nuôi cấy đục.
Vi khuẩn Acetobacter xylinum là vi khuẩn hiếu khí nên trên môi trường
nuôi cấy lỏng, tĩnh chúng tạo thành một lớp màng xenluloza và tế bào vi khuẩn nằm mắc ở trong đó. Màng này có thể dày, mỏng khác nhau và mang những đặc điểm tùy tính chất của từng loại.
3.3. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum
Để quan sát hình thái tế bào các vi khuẩn Acetobacter xylinum chúng tôi
tiến hành làm tiêu bản và nhuộm Gram 16 mẫu vi khuẩn trên. Lấy mẫu váng hoặc dịch nuôi cấy hoặc vi khuẩn cấy trong ống thạch nghiêng làm tiêu bản và
nhuộm Gram. Đưa lên kính hiển vi để quan sát thấy rằng vi khuẩn Acetobacter
xylinum là những trực khuẩn hình que, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi,
Khi quan sát trên kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần thấy rõ các tế bào vi khuẩn dài có kích thước khoảng 2 µm được bao bọc bởi một chất nhầy tạo thành váng dầy bắt màu hồng (khi nhuộm bằng thuốc nhuộm iôt và H2SO4 váng này bắt màu xanh do phản ứng của hemixenluloza). Trên kính còn có thể quan sát thấy sự bắt màu đậm nhạt khác nhau của các phần khác nhau bên trong tế bào vi khuẩn (Hình 5).
Hình 5. Ảnh vi khuẩn Acetobacter xylinum trên kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần
Từ kết quả so sánh về quá trình hình thành màng, độ dày màng, hình thái tế bào trên kính hiển vi của các mẫu, tôi đã chọn được một mẫu vi khuẩn
Acetobacter xylinum cho màng mỏng nhất (độ dày màng là 0.5 cm) có kí hiệu
G11. Chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum G11 có đặc tính cho màng mỏng hơn cả, màng dai, có màu trắng rất thich hợp để ứng dụng làm da nhân tạo.
Hình 6. Vi khuẩn Acetobacter xylinum G11 nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng
Chương 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Từ mẫu dịch lên men của hai nguồn nguyên liệu là giấm và dịch hoa
quả loãng, chúng tôi đã phân lập được 57 mẫu khuẩn lạc vi khuẩn axetic trong đó có 16 mẫu là vi khuẩn Acetobacter xylinum. Khi tiến hành thử khả năng lên màng của 16 mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum trên, kết hợp với quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần tôi đã chọn ra được một mẫu vi khuẩn Acetobacter
xylinum cho màng dai, mỏng nhất.
4.2. Kiến nghị
Trên đây là những kết quả nghiên cứu bước đầu của em về chủng vi
khuẩn Acetobacter xylinum G11 cho màng mỏng. Do thời gian nghiên cứu có hạn và do sự hạn chế của năng lực bản thân nên em không thể đi nghiên cứu
sâu hơn được về chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum G11 này. Em mong sẽ tiếp tục có những nghiên cứu tiếp theo về ảnh hưởng của những nhân tố như: (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, glucoza, pH,… từ đó tìm ra môi trường dinh
dưỡng thích hợp nhất cho sự tạo màng của chủng vi khuẩn Acetobacter
xylinum G11 cho màng mỏng.
Em rất mong nhà trường, khoa tạo điều kiện cho chúng em có thể
nghiên cứu sâu hơn về vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng. Đây là
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi
sinh vật học, Tập 1, Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
2. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi
sinh vật học, Tập 2, Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
3. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi
sinh vật học, Tập 3, Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật
học, Nxb Giáo dục, Hà Nội.
5. Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập vi sinh vật học (sách dịch), Nxb “Mir”
Moskwa, Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội.
6. Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo (1986), Vi sinh vật học, Nxb Giáo
dục, Hà Nội.
7. Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990), Thực
hành vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, Hà Nội.
8. Đinh Thị Kim Nhung (1997), Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi
khuẩn Acetobacter ứng dụng làm thạch dừa, Thông báo khoa học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, số 1, trang 181 – 186, Hà Nội.
9. Đinh Thị Kim Nhung (2000), Phân lập vi khuẩn Acetobacter từ một số
nguồn nguyên liệu ở Việt Nam, Báo cáo tổng kết đề tài cấp bộ, Hà Nội.
10. Nguyễn Thị Tuyến (2006), Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới
khả năng tạo màng của vi khuẩn Acetobacter xylinum N13, Khóa luận