2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét
2.1.2 Xác định độ acid (°T), pH và calcilactat tạo thành sau khi lên men
Các bước tiến hành:
+ Thanh trùng sữa bột ở 85-87°C/ 5-10phút + Làm nguội sữa đến nhiệt độ lên men(42°C)
+ Cấy chủng vi sinh vật với tỷ lệ 5% so với dịch lên men + Bổ sung chất đệm C aC 03 và VitaminBp( 2mcg/ml) + Lên men ở 42°c
Tiến hành các thí nghiệm lên men vi khuẩn lactic và kết quả trung bình được nêu trong bảng III,IV,V
♦ Kết quả đánh giá độ acỉd (°T), pH của dịch lên men lactic có C a C 0 3 làm chất đệm + Chủng Lactobacillus acidophilus Bảng III thời gian lên men Sữa bột 14% 17% 2 0% CaCO, CQ pH Orp1 CQ pH 0^ CQ pH 3h 0,5% - 4,32 74 + 4,34 94 + 4,30 101 0,7% - 4,36 71 - 4,38 78 + 4,35 98 1% - 4,38 66 - 4,40 68 + 4,38 88 3,5h 0,5% + 4,30 90 + 4,28 110 + 4,28 127 0,7% + 4,32 85 + 4,32 107 + 4,31 122 1% - 4,33 79 + 4,31 90 + 4,36 115 4h 0,5% + 4,28 101 + 4,22 118 - 4.21 136 0,7% + 4,30 94 + 4.24 109 - 4,26 134 1% + 4,32 86 + 4,27 97 + 4,30 128
Đánh giá cảm quan(CQ): (+) Đạt yêu cầu về chất lượng
(-) Không đạt yêu cầu về chất lượng
Nhận xét:
Với nồng độ sữa 17% và 0,7% CaC03 sau 3,5h lên men cho sản phẩm đạt chất lượng tốt nhất pH=4,32; °T=107 (So với mẫu chuẩn pH=4,3; °T=108,7)
+ Chủng Lactobacillus bulgaricus Bàng IV Thời gian lên men Sữa bột CaCO, \ 14% 17% 2 0% CQ pH 0T CQ pH 0^ CQ pH 0^ 3,5h 0,5% + 4,18 85 + 4,28 108 + 4,31 119 0,7% - 4,32 83 + 4,32 102 + 4,37 107 1% - 4,50 80 + 4,53 96 + 4,58 98 4h 0,5% + 4,16 87 + 4,21 114 + 4,26 123 0,7% + 4,26 85 + 4,29 112 + 4,34 117 1% - 4,42 82 + 4,43 98 + 4,46 112 4,5h 0,5% + 4,11 94 + 4,20 120 - 4,22 136 0,7% + 4,22 86 + 4,24 114 + 4,29 129 1% - 4,26 83 + 4,28 102 + 4,41 118
Đánh giá cảm quan(CQ): (+) Đạt yêu cầu về chất lượng
(-) Không đạt yêu cầu về chất lượng
Nhận xét:
Với nồng độ sữa 17% và 0,7% CaC03 sau 4h lên men cho sản phẩm đạt chất lượng tốt nhất pH=4,29; °T=112(So với mẫu chuẩn pH=4,26; °T=113,5)
♦ Bảng kết quả đánh giá lượng calcỉlactat tạo thành (g/1) khi lên men L. acidophilus và L. bulgarỉcus
Báng V
Chủng CaCO, Lên men
Sữa bôt (14%') Sữa bột (17%) Sữa bột (2 0%) L. acido- philus 0,5% 3(h) 13,61 15,23 16,90 3,5(h) 15,38 17,87 18,17 4(h) 16,20 18,98 18,73 0,7% 3(h) 18,73 20,20 21,51 3,5(h) 20,88 22,56 22,98 4(h) 21,41 23,97 23,34 1% 3(h) 21,36 23,83 24,60 3,5(h) 24,19 26,58 r 26,48 4(h) 24,82 26,70 27,23 L. bulga- ricus 0,5% 3,5(h) 14,48 16,41 16,55 4(h) 17,74 18,25 20,00 4,5(h) 18,53 19,14 21,69 0,7% 3,5(h) 20,38 23,50 25,63 4(h) 23,89 26,86 29,12 4,5(h) 24,64 28,23 30,57 1% 3,5(h) 23,52 25,32 26,92 4(h) 26,37 29,28 30,28 4,5(h) 27,11 28,93 30,73 Nhận xét:
Trong cùng điều kiện tiến hành lên men (đối với cả 2 chủng)
+ Calciỉactat tạo thành tỷ lệ thuận với lượng CaCOj (chất đệm) cho vào.
Calcilactat tạo thành trong lô thí nghiệm có 0,7% C aC 03 tăng mạnh so với lô thí nghiệm chỉ chứa 0,5% C aC 03. Khi tăng lượng C aC 03 lên 1% nhận thấy: lượng calcilactat tạo thành so với khi dùng 0,7% CaC03 không thay đổi đáng kể. Vì vậy trong sản xuất có thể dùng nồng độ 0,7% CaC03 là đủ.
+ Calcilactat tạo thành tỷ lệ thuận với lượng sữa cho vào ban đẩu .
Calcilactat tạo thành khi nồng độ sữa là 17% tăng mạnh so với lô thí nghiêm chỉ chứa 14% sữa. Khi tăng nồng độ sữa đến 20% nhận thấy lượng calcilactat cũng tăng nhưng không đáng kể. Vì vậy để lên men tạo calcilactat thì nồng sữa dùng
17% là đủ.
+ Calcilactat tạo thành tỷ lệ thuận với thời gian lên men.
Khi lên men lactic để chế tạo lactatcalci đã tiến hành trên 2 chủng vi sinh vật là L. acidophilus và L. bulgaricus nhận thấy:
Thời gian lên men để tạo lượng calcilactat thích hợp ở chủng L. acidophilus là
3,5h và chủng L. bulgaricus là 4h.
2.1.3 Kết quả phân tích dịch lên men bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
+ Để kiểm tra đặc điểm lên men sinh tổng hợp acid lactic, ta tiến hành bằng phương pháp phân tích sắc ký.
+ Chọn hệ dung môi: n-butanol / metanol / H20 = 20:1:20 + Cho chạy sắc ký
+ Kết quả sắc ký cho thấy hầu hết các mẫu phân tích chỉ xuất hiện có một vết, vết này có Rf trùng với vết acid lactic tinh khiết
Qua đó cho thấy cả 2 chủng vi khuẩn L. acidophilus và L. bulgaricus là những chủng lên men đồng hình.Vì vậy có thể sử dụng các chủng này để lên men lactic tạo lactatcalci hoặc làm sữa chua thì chất lượng sẽ tốt.
2.1.4 Thử độ nhạy cảm của một sô chủng vi khuẩn lactỉc với VtíaminBI2
Tiến hành thử nghiệm độ nhạy cảm của một số chủng vi khuẩn lactic được phân lập ở Trung tâm Vi sinh vật học ứng dụng của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên với VitaminB12.
• Cách tiến hành :
+ Đun chảy môi trường[L2 ], để nguội đến 42-45°C thì đổ nhũ dịch vi sinh vật vào, lắc đều rồi đổ vào các hộp petri, mỗi hộp 15ml. Đợi thạch đông rồi đục các lỗ bằng bộ đục lỗ chân không.
+ Nhỏ 0,lm l dung dịch VitaminBp 5mcg/ml vào các lỗ đã đục. Để hộp petri vào tủ ấm 37°c trcng 24h rồi đọc kết quả.( Bảng V I )
♦ K ết quả thử độ nhạy cảm của một sô chủng vi khuẩn lactic với VitaminBl2
Báng VI STT Tên chủng Đưòng kính 1 (đơn vị mm) Đường kính 2 (đơn vị mm) Đường kính 3 (đơn vị mm) Đường kính 4 (đon vị mm) 1 Lactobacilus sp. C4 — — _ _ 2 Lactobacillus sp. C6 — — _ _ 3 Lactobacillus sp. Dt — — _ _ 4 Lactobacillus sp. D4 — — _ _ 5 Lactobacillus sp. D5 — _ _ _ 6 L. kefir — _ _ _ 7 L. acidophilus _ _ _ _ 8 L. bulgaricus — — — _ 9 Lactobacilus sp. 20,5 20,2 19,8 20,3
(-) : chủng không nhạy cảm với VitaminBp
Như vậy trong 9 chủng vi khuẩn lactic đem thử chỉ có chủng số 9 là nhạy cảm với VitaminBp. Có thể tiến hành nghiên cứu sâu hơn về chủng này để dùng làm chủng kiểm định VitaminBp.
2.1.5 Xác định lượng VitaminB12 có trong sản phẩm sau khi lên men
Cách tiến hành như sau:
Bước 1:
+ Pha loãng dung dịch VitaminB12 chuẩn và dung dịch VitaminBl2 thử + ( dịch lên men) cần xác định
+ Dung dịch VitaminBp chuẩn pha chính xác 2 nồng độ lvà 2 mcg/ml + Dung dịch VitaminB12 thử pha xấp xỉ 2 nồng độ 1 và 2 mcg/ml
Bước 2:
Chuẩn bị vi sinh vật kiểm định là: chủng Lactobacilus sp.( giữ giống ở dạng đông khô), được nuôi cấy trong môi trường lỏng.
Bước 3:
+ Đun chảy môi trường định lượng VitaminBl2[L2], để nguội đến 37°c . Cho vi sinh vật vào, lắc đều rồi đổ vào các hộp petri vô trùng. Để đông đặc và đem đục 4 lỗ bằng bộ đục lỗ chân không.
+ Tiến hành nhỏ các dung dịch VitaminBp chuẩn và cần định lượng vào.
+ Sau đó để tủ ấm 37°c /24h cho phát triển, đem đo đường kính vòng phát triển rồi tính kết quả.
• Tính kết quả:
- Gọi M, là đường kính vòng phát triển của dung dịch VitaminB,9 chuẩn có nồng độ là c = 2mcg/ml
- Gọi Mo là đường kính vòng phát triển của dung dịch VitaminBp chuẩn có nồng độ là C/N = lmcg/ml
- Tương tự, gọi Tj là đường kính vòng phát triển của dung dịch VitaminBp cần xác định có nồng độ là X « 2mcg/ml
có nồng độ là X/N«lm cg/m l • Theo công thức tính (***);
(T, _ M2) : (Mị _ T2) = log(NX/C) : log(NC/X) Trong thí nghiệm này c = 2mcg/ml
N = 2:1 = 2 nên suy ra: (T, - M2) : (M, _ T 2) = (log2X/2) : log(4/X)
- (logX) : log(4/X) Kết quả thu được như sau:
♦ Kết quả định lượng VitaminB12 trong dịch lên men bằng Lactobacilus sp.
Bàng VII Dịch lên men M, (Đơn vị mm) m2 (Đơn vị mm) T, (Đơn vị mm ) t 2 (Đơn vị mm) X (mcg/ml) 1. 17,3 14,6 16,9 14,4 1,98 1, 16,9 14,7 16,6 14,2 1,82 17,1 14,5 16,7 13,9 1,81 ... 2i 17,0 14,6 16,7 14,2 1,90 2, 17,4 14,6 17,2 14,3 1,86 _ - 2, 17,3 14,8 16,8 14,5 1,82 3, 16,8 13,9 16,5 13,5 1,96 3, 17,4 14,4 17,0 14,0 1,93 3, 17,5 14,2 17,1 13,8 1,96 4, 16,8 13,9 16,4 13,6 1,97 4, 17,0 14,3 16,7 14,0 2,00 4, 16,9 14,2 16,5 13,8 1,90 5l 16,9 14,5 16,5 14,2 1,90 5, 17,2 14,4 16,8 14,2 1,99 5, 17,1 14,7 16,7 14,4 1,86 28
X trung bình đo được từ dịch lên men 1 là: 1,87 (mcg/ml) X trung bình đo được từ dịch lên men 2 là: 1,86 (mcg/ml) X trung bình đo được từ dịch lên men 3 là: 1,95 (mcg/ml) X trung bình đo được từ dịch lên men 4 là: 1,96 (mcg/ml) X trung bình đo được từ dịch lên men 5 là: 1,92 (mcg/ml)
Nhận xét:
Hàm lượng VitaminB12 lúc đầu cho vào dịch lên men là 2mcg/ml. Sau khi lên men hàm lượng VitaminBl2 trong
Dịch lên men 1 giảm: 6,5% Dịch lên men 2 giảm: 7% Dịch lên men 3 giảm: 2,5% Dịch lên men 4 giảm: 2% Dịch lên men 5 giảm: 4%
Như vậy sau quá trình lên men hàm lượng VitaminBl2 giảm nhưng không đáng kể so với hàm lượng VitaminBp cho vào lúc đầu. Điều này có thể được giải thích do sai số của phép định lượng vi sinh vật hoặc vi khuẩn lactic đã sử dụng một phần VitaminB12 để phát triển.
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT
1. K ết luận:
Sau khi thực hiện khoá luận chúng tôi đã thu được một số kết quả như sau:
1. Đã tiến hành thí nghiệm lên men lactic và nhận thấy sử dụng nguyên liệu là sữa đặc cho sản phẩm kém chất lượng hơn khi sử dụng nguyên liệu là sữa bột. Vì vậy lựa chọn nguyên liệu là sữa bột để lên men trong các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo.
2. Đã tiến hành thí nghiệm lên men lactic và lựa chọn được thời gian lên men(3,5h với L. acidophillus và 4h với L. bulgaricus), nồng độ sữa(17%), lượng C aC 03(0,7%) cho vào để thu được sản phẩm đảm bảo chất lượng ( mùi vị, độ acid, độ bền vững ) có calcilactat và vitaminB12.
3. Đã tiến hành phân tích dịch lên men bằng phương pháp sắc kývà xác định được chủng L. acidophilus và L. bulgaricus đều là các chủng lên men lactic đổng hình.
4. Đã tiến hành thử độ nhạy cảm của một số chủng vi khuẩn lactic với VitaminB12, kết quả đã lựa chọn chủng Lactobacillus sp. có thể dùng để định lượng VitaminB12 trong các chế phẩm có chứa VitaminB12.
5. Đã tiến hành xác định VitaminB12 có trong sản phẩm lên men sữa chua. Kết quả cho thấy hàm lượng VitaminB12 trong sản phẩm có giảm so với hàm lượng VitaminB12 ban đầu cho vào nhưng không đáng kể.
Như vậy bằng phương pháp lên men lactic có bổ sung CaCOj, VitaminB12
chúng tôi đã tạo được sản phẩm sữa chua có chứa calcilactat ( hàm lượng Ca+2xấp xỉ 5 mg/ml) và VitaminB12( hàm lượng xấp xỉ 2mcg/ml). Đây là sản phẩm mang giá trị dinh dưỡng đồng thời có tác dụng chữa bệnh cho trẻ em (chống còi xương, suy dinh dưỡng...) như một số dược phẩm của nước ngoài có chứa calcilactat và
vitaminBp. Sản phẩm đảm bảo yêu cầu về độ vô trùng, độ acid, độ đồng nhất và có hương vị thơm, ngon.
2. Đ ề xuất:
Việc chế tạo một loại thực phẩm có khả năng chữa bệnh, thuận tiện cho sử dụng, rẻ tiền là rất cần thiết và là một hướng nghiên cứu cần được quan tâm. Vì vậy đề tài này cần được tiếp tục nghiên cứu hoàn chỉnh thêm để có thể tạo ra được chế phẩm ứng dụng trong thực tế.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT:
1. Doãn N.N, Sinh học Vitamin, nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật 1987.
2. Dũng N.L , Một số phương pháp nghiên cứu Vi sinh vật học, tập 2, nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 1976.
3. Hùng N.K , Bài giảng Vitamin, ĐH Y, Dược HCM, 1991.
4. Koóng T.M , Bài giảng “ Định lượng VitaminB12 bằng phương pháp Vi sinh vật 1994.
5. Lượng N.D: Công nghệ Vi sinh vật, tập 3. Thực phẩm lên men truyền thống, trường ĐH kỹ thuật thành phố HCM, 1995.
6. Mims 1998 (trang 279, 287).
7. Trình T .v , Thương phẩm học hàng thực phẩm (Dầu mỡ ăn, sữa và sản phẩm chế biến), Dại học Thương nghiệp, 1991.
8. Vidal Việt Nam, 1999 (trang 58). TIẾNG ANH:
9. Bergey D., 1957, Manual of determinaltive Bacteriology. Williams and Wilkins, Baltimore. 2: 197-199.
10.Bill, D., Yang c. s., Morgan M. E., 1972. effect of sucrose on the production of acetaldehyde acid by yoghourt culture bacterial. J. Sci., 55: 1570-1573. 1 l.British Pharmacopoea 1993, vol I, II.
12.Buchta, K., 1983, Lactic acid, in Biotechnology vol. 3, Florida.
13. JW. Crueger, A. Crueger: Biotechnology ( Hung ), Text book Press, Budapest, 1987.
14.Kierstan M. Bucke c. 1977. The immollization of micobial cells, subcellular organelles and enzyme in calcium alginat gels. Biotechnol., 19: 387-397.
15.Litchefield J.H: Microbiological production of lactic acid, Advances in applied microbiology, Vol 12, 1996.
ló.Martindale. The Pharmaceutical Press London, 1993.
17.Metchnikoff, E., 1908. The prolongation of life. New York.
18.R. Meunier, p. Simom: Vi sinh công nghiệp và kỹ thuật hoá sinh học, tập 1