1. Dai cirtmg vè Saccharomyces cerevisiae
2.2. PHUONG PHÂP NGHIÊN CÜU
Dë thuc hiên dê tài này chüng tơi dâ sir dung câc phucmg phâp nghiên cüu sau:
2.2.1. Phirong phâp nuơi cây dë thu sinh khoi tir chung S. cerevisiae
+ Câ'y chung S. cerevisiae lân luçrt vào câc mơi truơfng nhân giơ'ng. Lac ơf 30°C/24 giơf vơi tơc dơ lâc 130 vơng/phüt.
+ Câ'y truyên lân luçrt tù mơi truơfng nhân giong sang mơi truơfng lên men. Lâc à 30°C/72 giơ, toc dơ lâc 130 vơng/ phüt dë tao sinh khoi.
+Dich lên men duçfc li tâm, vơi tơc dơ 4000 vơng/phüt trong 10 phüt. Sinh khơi thu duçfc dem sây khơ ơ 50°C dén dơ âm cơn 15%.
2.2.2. Phuomg phâp tu thuy phân tao acid amin tùr sinh khoi S. cerevisiae.
Cân sinh khơl cho vào cơc cơ mơ, bo sung nuơc vơi tÿ lê thich hop, ü trong tü âm à nhiêt dơ khâo sât. Sau mot không thơi gian ü âm lây cơc ra li tâm và loc lây dich trong.
2.2.3. Phuong phâp thuy phân protid trong sinh khoi S. cerevisiae sur
dung enzym.
Cân sinh khơl cho. vào cơc cơ mơ, bo sung nuơc vơi tÿ lê thich hçrp, ü trong tü âm ơ nhiêt dơ khâo sât. Sau mot thơi gian ü â'm lây cơ'c ra, cho thêm mot luçfng nhua mû du dü (chüa papain) roi dun ơ 80°C/20 phüt. Dë nguơi, li tâm và loc lây dich loc.
2.2.4.Dinh luong nito amin theo phuong phâp chuan dơ Formol. [12]
*. Nguyên tac chuan dơ Formol:
Khi cho formaldehyd vào, câc nhơm amin sê bi methyl hô và mât tỵnh kiêm. Acid amin trơ nên acid manh hơn và cơ thë tâc dung vơi kiêm. Cân cü vào luçfng NaOH tiêu hao ta tmh duçfc luçfng acid. Và do dơ tmh duçfc luçfng nito amin cơ trong mâu.
*. Tien hành chuàn dơ Formol.
+ Lây chfnh xâc 20 ml dich loc cho vào bïnh tam giâc 250 ml, dùng dung dich NaOH 1N chuan dén pH= 8,0. Xâc dinh diëm tuang duang bàng pH mét.
+ Cho thêm 10 ml BaCl2 vào, sau 15 phüt chuyën tồn bơ vào binh dinh mûc 200ml và thêm nuơc cât vùa du. Làc dêu, loc qua giây loc. Lâ'y dich loc.
+ Cho 25ml dung dich formaldehyd vào dich loc, làc dêu và dé yên trong không 2 phüt. Sau dơ chuan bàng dung dich NaOH 1N, nhơ pH met dén pH=8,0
Hàm luang nita amin(N2) duac xâc dinh theo cơng thuc sau: (nx 0,0014) x 1000
N2= --- ,(g/l) V
Trong do:
n: là sơ ml dung dich NaOH 0,1N tiêu hao à mâu thf nghiêm V : là sơ ml dich loc dâ lây phân tfch
0,0014 là sơ (g) N2 tuang ûng vơi 1ml dung dich NaOH 0,1N
2.2.5. Phuang phâp tinh chê acid amin bàng cơt trao doi ion.
2.2.5.1. Phuang phâp tinh che acid amin bang cơt nhua trao doi anion.
+ Chuan bi cơt trao doi anion: Cân không 15g hat nhua Amberlate IRA- 400, ngâm trong 100ml dung dich NaOH 1N trong 12 giơ. Sau dơ, cho vào cơt trao doi ion (dùng buret cơ lot à duơi mot lơp bơng thuÿ tinh, duơng kfnh lem), cơt khơng duac chira bot khf, dung dich phâi luơn ngâp trên hat nhua ft nhât 0,5cm trong quâ trỵnh chay sàc kÿ cüng nhu khơng chay. Rira cơt bàng nuơc cât cho dén khi nuơc chây ra dat pH=7,0 (phât hiên bàng giây quỵ tfm).
+ Chay sâc kÿ: Cho dung dich chûa acid amin lên cơt trao doi ion và cho chây vơi toc dơ 5-10 giot/phüt. Khi cơt dâ bâo hồ, rua cơt bàng nuơc cât dén khi nuơc chây ra khơng cơn kiêm (thir bàng thuơc thir Phenolphtalein).
+ Rira giâi cơt: Dùng dung dich HC1 1N cho chay tù tù qua cơt dë thu acid amin dén khi dich chày ra khơng con acid amin nüa thï ngùng (thü bàng thuơc thu Ninhydrin/aceton).
Dem dich sau rùa giâi câ't chân khơng quay dë loai bot nuơc. 2.2.5.2. phitang phâp tinh ché acid amin bàng cơt trao doi cation.
+ Chuan bi cơt trao doi cation: Cân không 15g hat nhua Dowex 50 WX, ngâm trong dung dich H2S04 1N trong 12 gicf. Sau dơ cho vào cơt trao doi ion (dùng buret cơ lot à duơi mot lơp bơng thuy tinh, ducmg kmh 1cm), cơt khơng duoc chüa bot khi, dung dich phâi luơn ngâp trên hat nhua ft nhât 0,5cm trong quâ trinh chay sâc kÿ cüng nhu khơng chay. Khi cơt dâ bâo hồ, rüa cơt bàng nuơc câ't cho dén khi nuơc chây ra khơng cơn acid tu do (thü bàng thuơc thü Heliantin)
+ Chay sâc kÿ:: Cho dung dich chüa acid amin lên cơt trao doi ion và cho chây vơi tơc dơ 5-10 giot/phüt. Rüa cơt bàng nuơc cât dén khi nuơc chây ra khơng cơn acid (thü bàng thuơc thü Heliantin).
+ Rüa giâi cơt: Dùng dung dich NH4OH 3N cho chây tù tù qua cơt dë thu acid amin dén khi dich chây ra khơng cơn acid amin nüa thỵ ngùng (thü bàng thuơc thü Ninhydrin/aceton).
Dem dich sau rüa giâi cơ chân khơng dë loai NH4OH.
2.2.6. Phuong phâp dinh tmh và dinh luong acid amin bàng sâc kÿ long hiêu nàng cao (RP-HPLC).[6]
Dë tâch và xâc dinh dơng thơi câc acid amin trong sinh khơi S. cerevisiae
bàng phucmg phâp RP-HPLC, chüng tơi chon câc diêu kiên:
+ Dùng dân xuât truơc cơt là 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate(AQC).
+ Câc diêu kiên phù hop cho chay RP-HPLC dê tâch và xâc dinh câc acid amin(18 acid amin) duoc lua chon nhu bâng 3 và 4 sau:
Bàng 3: Câc diêu kiên RP-HPLC dé tâch và xâc dinh 18 acid amin
TT Câc thơng so Câc diëu kiên duac chon
1 Cơt tâch RP 18,5 ^m(150nm x 4,6mm x 3,5^im)
2 Nhiêt dơ cơt 37°C
3 Toc dơ dơng lml/phüt
4 ■ The tfch bom mâu 20 |am
5 Nhiêt dơ mâu 30°C
6 Detector Huÿnh quang
7 Birơc sơng XEx=250nm;À,Em=395nm
8 Thành phân pha dơng: 3 thành phân, gradient
A:dêm acetate-phosphat pH5,05
B:acetonitril C: Nuơc cât 2 làn
Bang 4: Thành phân pha dơng chay sac kÿ cơ gradient Thdi gian
(phüt)
Tơc dơ dong
(mL/phüt) % Borat % Acetonitril %h2o Nên 1,0 100 0 0 0,5 1,0 99 1 0 18,0 1,0 95 5 0 19,0 1,0 91 9 0 29,5 1,0 83 17 0 33,0 1,0 0 60 40 36,0 1,0 100 0 0 65,0 1,0 0 60 40 100,0 1,0 0 60 40
2.3. KÊT QUÂ VÀ BÀN LUÂN.
Dé lua chon duoc qui trỵnh sân xuât acid amin tùr sinh khơi S. cerevisiae
chung tơi tién hânh câc nghiên cuu sau:
2.3.1. Khâo sât ânh hirơng cüa mơi truong nuơi cây S. cerevisiae toi khâ
nàng tao sinh khơi.
De thu duoc sinh khoi S. cerevisiae phuc vu cho viêc nghiên ciïu chiét tâch thu acid amin, chung tơi thuc hiên nuơi câ'y trên 3 mơi trucmg: MT1, MT2, MT3. Trỵnh tu tao sinh khơi nhu mơ tâ mue 2.2.1
Cân sinh khơl khơ trên cân phân tfch thu duoc két quâ nhu bâng 5 sau:
Bâng 5: Hàm luçmg sinh khơi khơ à câc mơi trucmg nuơi cây S. cerevisiae
Mơi truơng nuơi cây MT1 MT2 MT3
Khơi luçmg sinh
khơi khơ (g/l00ml) 0,5266 0,9625 0,3102
Nhân xét: Trong cùng diêu kiên và cùng nơng dơ nuơi cây nhu nhau, két quâ bâng 5 cho thây hàm luçfng sinh khơi cao nhât dat duoc à mơi truơng MT2. Théo lÿ thuyét, glucose thuơc nhơm monosaccarid là loai ducmg don mà
S. cerevisiae dơng hô dê dàng hon so vơi câc loai ducmg khâc nên thucmg nuơi cây à mơi truơng glucose cho sinh khơi nhiêu nhât so vơi câc mơi trucmg khâc. Nhung à dây, chung tơi thây mơi truơng cho nhiêu sinh khơi khơng phâi là mơi truơng glucose mà lai là mơi trucmg chûa saccarose trong ducmg phên (MT2). Diêu này cơ thé hiëu nhu sau: quâ trỵnh sinh truơng cüa S. cerevisiae
diên ra theo câc giai doan khâc nhau, bao gơm pha tiêm phât, pha logarit, pha cân bàng và pha suy vong. Trong nghiên cüu này chung tơi nuơi cây trong thofỵ gian 72 giơ, vơi không thcfi gian này thỵ à mơi truơng chûa glucose S. cerevisiae cơ le dâ nhanh chơng sü dung hét glucose nên chuyén sang pha suy vong truơc thefi gian 72 giơ, té bào S. cerevisiae già hô, phân huÿ hồ tan vào
mơi trucmg làm cho luçmg sinh khoi giâm. Con à mơi trucmg dura saccarose trong duơng phên do quâ trinh dơng hô duơng châm hơn nên trong không thơi gian 72 giơ S. cerevisiae vân cơn à pha logarit nên sinh khơi là cao nhât. Vi vây, trong nghiên cüu này chüng tơi chon mơi truơng chüa saccarose trong duơng phên dë nghiên cüu tiép.
2.3.2. Khâo sât ânh huong cua nơng dơ saccarose toi khâ nàng tao sinh khoi.
Chüng tơi khâo sât câc nơng dơ saccarose trong duơng phên sau: 5%, 10%, 15%, 20%, 25% lân luot tuong üng vơi câc mơi truơng sau: MT2, MT4, MT5, MT6, MT7.
Tién hành tao sinh khơi trên câc mơi truơng nhu ghi à mue 2.2.1. Két quâ thuc nghiêm thu duoc ghi à bâng 6.
Bâng 6: Khơl luçmg sinh khơl khơ S. cerevisiae à câc nơng dơ saccarose
Nơng dơ rỵ duơng 5% 10% 15% 20% 25%
Hàm luçmg sinh khơl khơ (g/l00ml) 0,9625 1,2904 1,6253 1,6283 1,6304 0.8 0.4 0.2 I Q 4— --- - r - — ■— -r — ■— — r --- — r --- ---1--- i 0 5 10 15 20 25 30
Nơng dơ rỵ durdng
Nhân xét: Tir kët quâ bàng 6 và hinh 2 chüng tơi thay khi nơng dơ saccarose trong duơng phên tâng thỵ hàm luong sinh khơl cüng tâng và tàng rơ rêt nhât tir nơng dơ duơng phên 15%. Nhimg néu tiép tue tàng nơng dơ saccarose thỵ hàm luong sinh khơl tàng khơng dâng kë. Dièu này là do trong diêu kiên nuơi cây vè nhiêt dơ và thơi gian nghiên cuu, S. cerevisiae chỵ su dung tơi da luong duơng tuomg üng vơi nơng dơ saccarose là 15%. Cơn khi tâng saccarose tiëp luçrng sinh khơl tâng khơng dâng kë, phân tàng này cơ thë là phân cân cüa duơng phên cơn du.
Tir dơ chüng tơi chon nơng dơ saccarose 15% dë lên men thu sinh khơl
S.cerevisiae.
Tù két quâ thu duçfc nêu trên mue 2.3.1 và mue 2.3.2 chüng tơi lua chon diêu kiên thfch hop nuơi cây S. cerevisiae dë cho hàm luong sinh khơl cao là: Mơi truơng saccarose trong duơng phên vơi nơng dơ 15% (tuong üng MT5)
2.3.3. Khâo sât ânh hirơng cûa nhiêt dơ và thơi gian dén quâ trỵnh tir thuÿ
phân giâi phơng acid amin tù sinh khoi S. cerevisiae.
Sau khi thu duoc sinh khơl tù S. cerevisiae, chüng tơi tién hành thuÿ phân sinh khơl dë thu acid amin, truơc hét su dung quâ trỵnh tu phân. Dë chon diêu kiên tu phân thfch hçfp chüng tơi nghiên cüu ânh huơng cüa nhiêt dơ và thơi gian dén quâ trỵnh tu phân.
Tién hành tu phân à câc nhiêt dơ: 32°C, 37°C, 42°C, 44°C, 47°C, 52°C. Ơ mơi nhiêt dơ lai khâo sât câc không thơi gian là: 6giơ, 24 giơ, 30 giơ, 48giơ.
Tai mơi nhiêt dơ và thơi gian tu phân chüng tơi sir dung 10g sinh khơl tuoi, tÿ lê (sinh khơl: nuơc) = 1:1 và tién hành nhu ghi à mue 2.2.2
Dinh luong acid amin trong dich loc sau khi tu phân bâng kÿ thuât dinh luong nito amin nhu ghi à mue 2.2.4.
Bâng 7: Hàm luçmg nito amin biên doi theo nhiêt dơ và thơd gian tu phân. Hàm luong nito amin (g/l)
^ ^ '- ^ N h i ê t dơ Thcfi g i a n ^ ^ - ^ 32°C 37°C 42°C 44°C 47°C 52°C 6 g-iơf 0,183 0,266 0,371 0,382 0,328 0,386 24 giof 0,232 0,287 0,487 0,391 0,308 0,375 30 giof 0,240 0,308 0,448 0,368 0,315 0,342 48 gid 0,251 0,322 0,399 0,307 0,312 0,308 Hàm luçmg nitü amin (g/l) 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 -4-6h • 24hj 30h 48h Nhiêt dơ 30 34 38 42 46 50 54
Hỵnh3: DƠ thi biëu diên hàm luçmg nito amin biên doi theo nhiêt dơ và thcfi gian tu phân
Nhân xét: Qua bâng 7 và hinh 3 chüng tơi thày hàm luçmg nito amin khơng tàng dơng dêu theo nhiêt dơ và thcfi gian mà hàm luçmg này dat giâ tri cao nhât à 42°C sau thcfi gian tu phân 24 gicf. Nhu vây, diêu kiên thich hçfp cho quâ trinh tu phân cüa sinh khoi S. cerevisiae dë giâi phơng acid amin tơt nhât là:
- Nhiêt dơ: 42°C. - Thơti gian: 24 gicf.
2.3.4. Khâo sât ânh hirơng cüa tÿ lê nud^c dén quâ trỵnh tir phân
Dé chon duoc tÿ lê (sinh khoi: nuơc) sur dung trong quâ trỵnh tu phân sinh khơl S. cerevisiae, trong nghiên cûu này chung tơi sir dung 10g sinh khơl tuai cho mơi tÿ lê và khâo sât câc tÿ lê (sinh khoi: nuơc) sau:
A = 1:0,75; B= 1:1; C = 1:1,5; D = l : 2
Tai mơi tÿ lê chüng tơi lai khâo sât à câc nhiêt dơ: 32°C, 37°C, 42°C, 44°C, 47°C, 52°C.
Tién hành quâ trinh tu phân trong 24 giơ nhu mơ tâ mue 2.2.2.
Dinh luçmg acid amin trong dich sau khi tu phân bàng kÿ thuât dinh luçmg nito amin theo phuong phâp chuân Formol ghi à mue 2.2.4
Két quâ thurc nghiêm duoc ghi à bâng 8:
Bâng 8: Hàm luçmg nito amin bién doi theo nhiêt dơ và tÿ lê tu phân " ' ^ ^ ^ T ÿ l ê
Nhiêt d ơ ^ ^ ^ ^ ^ ^
Hàm luçmg nito amin (g/l)
A B C D 32°C 0,094 0,127 0,132 0,105 37°C 0,186 0,253 0,248 0,173 42°C 0,312 0,485 0,308 0,266 44°C 0,355 0,401 0,297 0,204 47°C 0,264 0,370 0,286 0,200 52°C 0,267 0,308 0,289 0,271
Hàm lirçfng nita amin (g/l)
Hinh 4: Hàm luong nita amin bien d6i theo nhiêt dơ và tÿ lê nuơc
Nhân xét: Két quâ bâng 8 và hỵnh 4 cho thay hàm luong nita amin khơng tâng dơng dêu theo tÿ lê và nhiêt dơ tu phân, mà giâ tri này dat duac cao nhât tai tÿ lê B vơi nhiêt dơ tu phân là 42°C. Turc là trong diêu kiên này khâ nâng tu phân cüa sinh khơi cho hàm luong acid amin cao.
Nhu vây, két hop mue 2.3.3 và mue 2.3.4 chüng tơi di dén lua chon câc diêu kiên tu phân thfch hop nhât cüa sinh khơi S. cerevisiae dë thu duac acid amin cao là:
- Tÿ lê (sinh khơi: nuơc) = 1:1 - Nhiêt dơ tu phân: 42°C - Thơi gian tu phân: 24 giơ
2.3.5. So sânh khâ nàng thuÿ phân sinh khơi S. cerevisiae giüra hai quâ
trỵnh: tu phân và tu phân cơ enzym.
Dë nghiên cüu quâ trỵnh thuÿ phân sinh khơi S. cerevisiae cho hiêu suât acid amin cao chüng tơi nghiên cüu tiép ânh huang cüa enzym tơi quâ trỵnh
thuÿ phân. Thuc hiên nghiên curu này chung tơi su dung 10g sinh khơi tuai, tÿ lê (sinh khơi: nuơc) =1:1 cho mơi quâ trỵnh thuÿ phân và so sânh khâ nâng giâi phơng acid amin giüa hai quâ trỵnh: tu phân và tu phân cơ enzym. Câ hai quâ trỵnh dêu duac u ơ 42°C/24 giơ, sau dơ quâ trỵnh tu phân thỵ dem li tâm và thu dich trong cơn quâ trỵnh tu phân cơ enzym sau khi ü âm cho tiép enzym vào dun 80°C/20 phüt, de nguơi và li tâm lây dich loc trong.
Tai mơi quâ trỵnh, khâo sât vơi câc không thơi gian: 6 giơ, 24 giơ, 30 giơ, 48 giơ.
Qua tham khâo nhiêu tài liêu nghiên ciru truơc dây, chung tơi thây râng papain duac lua chon de thuÿ phân protein [8]. Do uu diëm cüa enzym này cơ khâ nàng thuÿ phân tơt câc protein, bên vơi nhiêt (cơ thé dén 100°C), nguyên liêu dùng de tinh ché papain dê kiém và rè. Do dơ chung tơi cüng lua chon papain dë xuc tâc cho quâ trỵnh thuÿ phân sinh khơi. Trong nghiên ciïu này, papain duac sü dung duơi dang papain trong nhua du dü tuai (ơ dây nhua du dü tuai sü dung là 10g tuang ûng 300mg papain [8]).
Dinh luang acid amin trong dich loc cüa mơi quâ trỵnh thuÿ phân sinh khơi S. cerevisiae bang kÿ thuât dinh luang nita amin theo phuong phâp chuân Formol ghi à muc2.2.4
Két quâ thu duac ơ hai quâ trỵnh chỵ rơ ơ bâng 9.
Bâng 9: Hàm luang nita amin bién dơi theo thơi gian cüa hai quâ trỵnh: tu . phân và tu phân cơ papain
QT thuÿ phân Thơi g i a n ^ \ .
Hàm luang nita amin (g/l)
Tu phân Tu phân + papain
6 giơ 0,371 0,974
24 giơ 0,487 1,258
30 giơ 0,446 0,856
Nhân xét: Tù két quâ bâng 9 chüng tơi thay, à mơi quâ trinh thuy phân sau thcfi gian 24 giơ néu tâng tiép thơi gian tu phân thi hàm luçfng nito amin lai giâm, co thë sau 24 gicf quâ trỵnh tu phân mci xây ra manh mê nhât và câc acid amin duçfc tao ra trong dich càng nhiêu. Tuy nhiên, acid amin khi ton tai dang tu do rât dê bi oxy hô cho nên néu kéo dài thcfi gian tu phân tù sau 24 giơf quâ trỵnh oxy hô acid amin càng xây ra nhiêu nên luçmg acid amin thu duoc trong dich thuy phân càng thâp. Vi vây, diêu kiên tu phân sinh khơi S.