Năm 1960 Spirulina sp. mới bắt đầu được biết đến. Năm 1963, Viện dầu hỏa Pháp đã bắt đầu quan tâm đến báo cáo về loại bánh tảo Dihe làm từ Spirulina sp. Họ đã tiến hành nghiên cứu loại tảo này trong phòng thí nghiệm rồi xây dựng quy trình sản xuất thử. Tuy nhiên điều kiện tự nhiên của nước Pháp không thuận lợi để nuôi trồng loại tảo này.
Năm 1973, Tổ chức Lương nông quốc tế và Tổ chức Y tế thế giới đã chính thức công nhận Spirulina sp. là nguồn dinh dưỡng và dược liệu quý, đặc biệt trong chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa. Đáng lưu ý là công trình nghiên cứu phòng chống ung thư gây ra bởi tia phóng xạ hạt nhân cho các nạn nhân của sự cố Nhà máy Điện hạt nhân Chernobul thu được kết quả rất tốt khi điều trị bằng Spirulina sp. nguyên chất. Khi uống Spirulina, lượng chất phóng xạ được đào thải khỏi đường tiểu của người bị nhiễm xạ rất cao. Kết quả này đã được biểu dương tại hội nghị quốc tế về tảo năm 1998 ở cộng hòa Czech. Tại Ấn Độ, một nghiên cứu năm 1995 đã chứng tỏ Spirulina, có tác dụng trị ung thư ở những bệnh nhân ung thư do thói quen nhai trầu thuốc. Ở Nhật Hiroshi Nakamura cùng Christopher Hill thuộc Liên đoàn vi tảo quốc tế cùng một số nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu Spirulina sp. từ năm 1968. Hiện nay ở Nhật cũng đang nghiên cứu chống HIV/AID sử dụng Spirulina.
Sản lượng Spirulina sp. hiện nay trên thế giới khoảng 1000 tấn khô/năm. Những nước đi đầu sản xuất đại trà loại tảo này là Mêhicô, Mỹ, Nhật, Đài Loan, Ấn Độ, Israel. Trại tảo lớn nhất là ở Hawaii có khoảng 25 ha và mới đây là Trung Quốc có khoảng 16 ha. Nhu cầu Spirulina sp. trên thế giới là rất lớn, tuy nhiên sản lượng chưa nhiều, nên giá bán những chế phẩm từ chúng rất đắt. Gần đây việc phát hiện và đưa vào sử dụng một số chất có hoạt tính sinh học ở Spirulina sp. đã góp phần không nhỏ thúc đẩy quá trình nghiên cứu, sản xuất cũng như ứng dụng có hiệu quả sinh khối tảo này.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 16 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu 3.1.1. Thời gian và địa điểm
- Thời gian thực hiện: từ tháng 08 năm 2013 đến tháng 11 năm 2013
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Nguyên liệu
Tảo Spirulina được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
3.1.3. Thiết bị
Thiết bị, dụng cụ:
- Bộ micropipette Gibson (Đức). - Máy vortex (HEIPOLTH, Đức)
- Máy ly tâm eppendorf centrifuge 5417R (Đức) - Máy quang phổ Spectrophotometer
- Kính hiển vi quang học (Olympus Optical, BH-2, Nhật) - Cân điện tử Sartorius (Đức)
- Tủ lạnh -200C Electrolux Confor Plus (Thụy Điển)
- Các dụng cụ thí nghiệm như: ng nghiệm có nắp, pipet, kính lúp, lam, lamen, dao, đầu col, bình tam giác, máy sục khí, bình nuôi 5 lít…
Hóa chất
Các hóa chất pha môi trường Zarrouk, nước cất, acetone, cồn tuyệt đối, cồn 70O và các hóa chất khác.
Môi trường nuôi tảo Spirulina sp. là môi trường Zarrouk (Zarrouk, 1966 và Bharat Gami et al., 2011) gồm 3 nhóm hóa chất, 1 nhóm đa lượng và 2 nhóm vi lượng, được pha với thành phần như sau:
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 17 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Bảng 3. Thành phần đa lƣợng trong môi trƣờng Zarrouk (g/l)
Tên hóa chất Khối lƣợng
NaNO3 2,5 NaCl 1 MgSO4.7H2O 0,2 CaCl2.H2O 0,04 FeSO4.7H2O 0,01 Na2EDTA 0,08 NaHCO3 16,8 K2HPO4 0,5 Na2CO3 7,6
Bảng 4. Dung dịch vi lƣợng A5 trong môi trƣơng Zarrouk (g/l)
Tên hóa chất Khối lƣợng
H3BO3 2,86
MnCl2.4H2O 1,81
ZnSO4.7H2O 0,22
CuSO4.5H2O 0,08
Bảng 5. Dung dịch vi lƣợng B6 trong môi trƣờng Zarrouk (g/l) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tên hóa chất Khối lƣợng
NaMoO4.2H2O 0,018
NiSO4.7H2O 0,048
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Nuôi tăng sinh
Pha môi trường Zarrouk, cách pha môi trường:
- Pha 2 dung dịch vi lương A5 và B6 (xem thành phần ở mục 3.1.3) riêng, khử trùng nhiệt ướt và để nguội.
- Pha các hóa chất đa lượng, lưu ý khuấy đều cho tan hết hóa chất trước khi cho hóa chất mới vào để tránh kết tủa.
- Cho 4 ml dung dịch A5 và 4ml dung dịch B6 vào mỗi lít môi trường cần pha. Chọn mẫu tảo: chọn ống nghiệm có mật độ tảo tương đối cao và kiểm tra mẫu tảo dưới kính hiển vi, tránh trường hợp tảo bị nhiễm các dòng khác.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 18 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Chuẩn bị 15 ống nghiệm (mỗi ống chứa 5ml môi trường Zarrouk), Chuyển 500 µl mẫu tảo gốc vào mỗi ống nghiệm mới. Sau đó nuôi tảo ở nhiệt độ phòng, chiếu sáng 24/24 giờ.
Chuẩn bị 2 bình tam giác 500ml, mỗi bình chứa 200ml môi trường Zarrouk đã khử trùng đậy bằng nút gòn.
Chủng vào mỗi bình tam giác tảo trữ đã được nhân giống (tỉ lệ 20% tảo).
Đặt 2 bình tam giác trong tủ nuôi tảo ở nhiệt độ phòng, chiếu sáng liên tục 24/24 giờ, sục khí CO2 liên tục bằng máy sục khí trong 7 ngày.
Chuyển tảo giống bình tam giác 1 lít sang bình nhựa 5 lít. Sục khí liên tục với chu kỳ chiếu sáng 24/24 trong 1 tuần ở nhiệt độ phòng.
Theo Vi Huỳnh Tiến Đạt (2011) nồng độ nuôi cấy tảo ban đầu là 20% là nồng độ thích hợp để nuôi cấy tảo Spirulina sp.
3.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của các nguồn đạm khác nhau lên khả năng tăng sinh và tích lũy β-carotene ở tảo Spirulina sp.
Mục đích thí nghiệm: tìm ra nguồn đạm tối ưu cho sự tăng sinh khối và tích lũy săc tố ở tảo Spirulina sp.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố là nguồn đạm với các nguồn khác nhau là NH4Cl, Urea và KNO3. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Tiến hành thí nghiệm: Spirulina sp. được nuôi với thể tích là 500 ml trong bình có dung tích 1l, tỉ lệ chủng tảo 20%, ở nhiệt độ phòng, sục khí liên tục, chiếu sáng 24/24h. Nguồn đạm trong môi trường được thay thế lần lượt bằng các chất NH4Cl, Urea và KNO3 với nồng độ bằng nhau là 0,2g/l.
Thu sinh khối và đo hàm lượng β-carotene ở các ngày thứ 5, 7, 9. Chọn nguồn đạm cho kết quả tối ưu để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
Mục đích thí nghiệm: Xác định nguồn đạm thích hợp nhất để tiến hành thí nghiệm tiếp theo
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
3.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của các nồng độ đạm khác nhau lên khả năng tăng sinh và tích lũy β-carotene ở tảo Spirulina sp.
Mục đích thí nghiệm: tìm ra nồng độ đạm tối ưu cho sự tăng sinh khối và tích lũy săc tố ở tảo Spirulina sp.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần. Tiến hành thí nghiệm: Spirulina sp. được nuôi với thể tích là 500 ml trong bình dung tích 1l, tỉ lệ chủng tảo 20%, ở nhiệt độ phòng, sục khí liên tục, chiếu sáng 24/24h. Chọn nguồn đạm cho kết quả tối ưu ở thí nghiệm trước để tiến hành thí nghiệm với các nồng độ đạm lần lượt là 0 g/l, 0,03 g/l, 0,05 g/l, 0,1g/l, 0,2g/l, 0,3 g/l, 0,4 g/l.
Thu sinh khối và đo hàm lượng β-carotene ở các ngày thứ 5, 7, 9.
Phƣơng pháp thu sinh khối và xác định hàm lƣợng β-carotene trong tảo
Spirulina sp.
Phƣơng pháp thu sinh khối (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2. Vi tảo Spirulina sp. đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.1
Sinh khối Spirulina sp. được thu bằng giấy lọc Whatman theo các bước sau: - Chuẩn bị giấy lọc có kích thước bằng nhau
- Đánh số thứ tự giấy lọc, sấy khô ở 105O
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
trọng lượng giấy lọc.
- Thu 50 mL tảo từ các mẫu, tiến hành lọc và sấy khô mẫu ở 105OC trong 24 giờ, sau đó cân và ghi nhận trọng lượng mẫu, so sánh với trọng lượng giấy lọc ban đầu suy ra khối lượng tảo thu được.
Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng β-carotene
Hình 3. Quy trình xác định hàm lƣợng carotenoid trong tảo bằng phƣơng pháp quang phổ
Hút 2 ml tảo ở các nghiệm thức khác nhau cho vào eppendorf. Mẫu tảo được ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút để thu sinh khối.
ly tâm 10000rpm trong 10 phút
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đổ bỏ phần dung dịch phía trên, thu phần tảo lắng phía dưới đáy eppendorf. Rửa mẫu bằng 2ml nước cất vô trùng nhằm loại bỏ lượng muối còn lại trong sinh khối tảo, ly tâm và thu phần tảo lắng phía dưới eppendorf. Quá trình rửa lặp lại 2 lần.
Phần sinh khối sau khi ly tâm được bổ sung 2ml acetone 80%, vortex mạnh trong 15 giây để đồng hóa mẫu. Để trong tối 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó ly tâm mẫu ở 6000 vòng/phút trong 10 phút. Dựa vào khả năng hấp thụ quang của các sắc tố trong tế bào, lấy phần dịch phía trên sau khi ly tâm đo ở các bước sóng 663nm, 646nm và 470 nm với mẫu đối chứng là acetone 80%. Áp dụng công thức của Lichtenthaler and Welburn (1983) để tính nồng độ β-carotene
Chlorophyll a (µg/ml) = 12,21 x (A663) – 2,81 x (A646) Chlorophyll b (µg/ml) = 20,13 x (A646) – 5,03 x (A663)
Carotenoid (µg/ml) = (1000A470 – 3,27 x [chl a] – 104 x [chl b])/227
Kết quả thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phương pháp phân tích ANOVA và phần mềm STAT GRAPHIC.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của các nguồn đạm khác nhau lên khả năng tăng sinh và tích lũy β-carotene ở tảo Spirulina sp.
Vi tảo Spirulina sp. được nuôi trong môi trường Zarrouk với nguồn đạm NaNO3 được thay thế bằng các nguồn đạm khác nhau để đánh giá ảnh hưởng của nitơ đối với sự phát triển và tích lũy β-carotene trong tế bào. Theo các thí nghiệm thăm dò ban đầu đối với các nguồn đạm khác nhau, nồng độ 0,2 g/l N là thích hợp nhất để vi tảo có thể phát triển ở tất cả các nghiệm thức. Do đó, nồng độ này được chọn để khảo sát ảnh hưởng của các nguồn đạm khác nhau lên sinh khối và sụ tích lũy β-carotene ở Spirulina sp.. Kết quả thí nghiệm cho thấy ở ngày thứ 7, khối lượng tảo và hàm lượng β-carotene ở đa số các nghiệm thức là cao nhất (Bảng 5, 6).
Bảng 5. Ảnh hƣởng của các nguồn đạm khác nhau đến sự phát triển sinh khối ở tảo Spirulina sp. (g/50ml)
Nghiệm thức Ngày 0 Ngày 2 Ngày 5 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 12
KNO3 0,037a 0,056a 0,087b 0,135bc 0,123b 0,103b
NaNO3 0,037a 0,057a 0,090b 0,140b 0,118b 0,111b
NH4Cl 0,037a 0,037c 0,073c 0,130c 0,110c 0,104b
Urea 0,037a 0,048b 0,107a 0,196a 0,151a 0,141a
CV % 4,36 16,87 14,98 18,38 13,21 14,76
Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cùng một cột, cùng chỉ tiêu khảo sát có mẫu tự theo sau giống nhau thì khác
biệt không có ý nghĩa ở mức độ 5% theo phép thử LSD.
Bảng 6. Ảnh hƣởng của các nguồn đạm khác nhau đến sự tích lũy carotenoid ở tảo Spirulina sp. (μg/ml) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nghiệm thức Ngày 0 Ngày 2 Ngày 5 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 12
KNO3 0,048a 0,381a 1,386a 1,146b 0,83c 0,647d
NaNO3 0,047a 0,386a 1,379a 1,031b 0,867c 0,814c
NH4Cl 0,050a 0,134c 0,508b 0,644c 1,17b 0,985b
Urea 0,045a 0,236b 1,324a 1,168a 1,276a 1,085a
CV % 12,33 39,17 33,87 33,26 19,67 20,34
Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cùng một cột, cùng chỉ tiêu khảo sát có mẫu tự theo sau giống nhau thì khác
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Quan sát thí nghiệm ở ngày 2 cho thấy ở nghiệm thức sử dụng nguồn nitơ là Urea và NH4Cl mật số tảo giảm rõ rệt so với nghiệm thức sử dụng KNO3 và NaNO3 do chúng chưa thích nghi được với nguồn nitơ mới. Đối với nghiệm thức sử dụng Urea, sinh khối và hàm lượng carotenoid khác biệt có ý nghĩa ở mức độ 5% so với KNO3 và NaNO3. Ở nghiệm thức sử dụng NH4Cl, sinh khối và carotenoid thấp hơn khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% so với các nghiệm thức sử dụng Urea.
Hình 4. Vi tảo Spirulina sp. qua 2 ngày nuôi với 4 nguồn đạm khác nhau
Sang ngày 5, vi tảo Spirulina sp. ở các nghiệm thức sử dụng Urea và NH4Cl đã thích nghi và phục hồi, do đó có sự tăng trưởng về sinh khối và hàm lượng β-carotene. Ở nghiệm thức sử dụng Urea, Spirulina sp. có sự phục hồi nhanh hơn và cho thấy sự thích nghi tốt khi khối lượng tảo và β-carotene thu được cao hơn có ý nghĩa ở mức 5% so với nghiệm thức đối chứng (sử dụng NaNO3) và nghiệm thức sử dụng KNO3. Tuy nghiệm thức sử dụng NH4Cl Spirulina sp. đã thích nghi được và phát triển nhưng khối lượng tảo và hàm lượng β-carotene vẫn thấp hơn có ý nghĩa ở mức 5% so với nghiệm thức đối chứng. Bên cạnh đó, có hiện tượng đứt đoạn của các sợi tảo ở NT sử dụng NH4Cl so với các nguồn đạm khác, ảnh hưởng đến sự phát triển của vi tảo. (Hình 5)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Hình 5. Tảo Spirulina sp. quan sát dƣới kính hiển vi ở ngày thứ 5 ở vật kính E40
a. KNO3 b. NH4Cl c. NaNO3 d. Urea
Ở ngày 7, khối lượng vi tảo Spirulina sp. thu được ở các nghiệm thức là cao nhất. Khối lượng tảo ở nghiệm thức KNO3 và NaNO3 khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%, trong khi đó ở nghiệm thức sử dụng Urea cho kết quả cao hơn có ý nghĩa ở mức độ 5% so với KNO3 và NaNO3. Kết quả tương tự cũng được tìm thấy trong một nghiên cứu của Danesi et al. (2002). Khối lượng tảo ở nghiệm thức sử dụng NH4Cl thấp hơn có ý nghĩa ở mức độ 5% so với NaNO3. Tương tự, hàm lượng β-carotene thu được ở nghiệm thức sử dụng Urea là cao nhất và khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Ở
a) b)
c)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
nghiệm thức sử dụng KNO3 và NaNO3, hàm lượng carotenoid đã giảm so với ngày 5 mặc dù sinh khối vẫn tăng.
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một đơn vị tính có mẫu tự giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5% theo phép thử LSD.
Hình 6. Ảnh hƣởng của các nguồn đạm khác nhau lên sinh khối và hàm lƣợng β-carotene trong vi tảo Spirulina sp. ở ngày 7.
Sang ngày 9 và ngày 11, khối lượng tảo và hàm lượng β-carotene ở tất cả các nghiệm thức đều giảm dần. Vào thời điểm này, quá trình sinh trưởng và tích lũy các chất trong tế bào bắt đầu giảm do thiếu nguồn dinh dưỡng.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
KNO3 NaNO3 NH4Cl Urea
bc b c a
b
b
c
a (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Hình 7. Ảnh hƣởng của các nguồn đạm khác nhau đến sinh khối tảo Spirulina sp. qua các ngày
Hình 8. Ảnh hƣởng của các nguồn đạm khác nhau đến hàm lƣợng carotenoid của Spirulina sp. qua các ngày
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
Ngày 0 Ngày 2 Ngày 5 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 12 g/50ml KNO3 NaNO3 NH4Cl Urea 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
Ngày 0 Ngày 2 Ngày 5 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 12
μg/ml
KNO3 NaNO3 NH4Cl Urea
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Nhìn chung, nghiệm thức sử dụng Urea cho kết quả cao và thích hợp nhất để làm nguồn đạm thay thế cho NaNO3 trong quá trình nuôi cấy tảo Spirulina sp.. Bên cạnh đó, giá thành của Urea thấp hơn nhiều so với NaNO3, do đó sẽ mang lại lợi ích kinh tế lớn khi nuôi trồng ở quy mô công nghiệp. Ngoài ra, nguồn đạm trong Urea sẽ chuyển hóa thành ammonia trong môi trường giúp Spirulina sp. dễ dàng hấp thụ, còn đối với nitrate thì phải