3.1. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện bằng 2 đợt thí nghiệm, đợt thí nghiệm ngắn ngày (14 ngày) và đợt thí nghiệm dài ngày (56 ngày)
3.1.1. Thí nghiệm ngắn ngày
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức ở 6 mức nhiệt độ khác nhau, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần với tất cả 18 bể. Mỗi bể đều có hệ thống lọc nƣớc tuần hoàn.
Nghiệm thức 1: 24°C
Nghiệm thức 2: nhiệt độ môi trƣờng bình thƣờng (27-29°C) Nghiệm thức 3: 30°C
Nghiệm thức 4: 32°C Nghiệm thức 5: 34°C Nghiệm thức 6: 36°C
Cá đƣợc bố trí vào bể 500 L với mật độ 45 con/300 L nƣớc.Tiến hành nâng nhiệt độ mỗi ngày ở mức 2°C/ngày đến khi đạt nhiệt độ mong muốn. Các bể ở nghiệm thức nhiệt độ cao đƣợc thuần dƣỡng nhiệt độ trƣớc, cụ thể là ở các bể 36, 34, 32°C đƣợc thuần dƣỡng chênh lệch nhau theo ngày. Đối với nghiệm thức 24°C đƣợc bố trí trong phòng lạnh (sử dụng máy lạnh để hạ nhiệt độ), khi nhiệt độ nƣớc bể thí nghiệm đạt 24°C (1 ngày sau khi thả cá vào bể). Thời điểm ngày 0 đƣợc xác định là thời điểm mà tất cả các bể đạt đƣợc nhiệt độ bố trí.
Các bể đƣợc sục khí liên tục giữ nhiệt độ ổn định ở mỗi mức để đảm bảo điều kiện thí nghiệm. Trong thời gian thí nghiệm, cá đƣợc cho ăn 2 lần/ngày tùy theo nhu cầu ăn của cá, thức ăn thừa đƣợc vớt ra khỏi bể sau khi cho ăn.
18
Trong suốt thời gian thí nghiệm, cá chỉ đƣợc thay nƣớc 30% vào ngày thứ 7 của thí nghiệm. Chất lƣợng nƣớc trong bể thí nghiệm đƣợc đảm bảo nhờ việc thƣờng xuyên thay túi lọc tuần hoàn và siphon đáy nếu có cặn đóng ở đáy bể.
Ghi nhận số liệu
Trong thời gian thí nghiệm thu các số liệu về môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, pH, oxy hòa tan và thức ăn sử dụng đƣợc ghi nhận hàng ngày.
Thu mẫu
Cá đƣợc thu mẫu máu vào buổi sáng (7:30 đến 10:30) ở các ngày 0, ngày 1, ngày 4, ngày 7 và ngày 14. Cá đƣợc bắt ngẫu nhiên từ các bể (mỗi bể 03 con). Trong vòng 5 phút, cá đƣợc cân, rút máu và đo chiều dài. Máu đƣợc thu bằng bơm kim tiêm 1ml đã tráng qua Heparin. Lƣợng máu thu khoảng 0,3-0,5 ml/mẫu và đƣợc trữ tuýp nhựa 1,5 ml đƣợc ký hiệu riêng cho từng nghiệm thức. Mẫu đƣợc giữ lạnh trên nƣớc đá trong suốt thời gian lấy mẫu. Sau khi thu máu cá xong, tiến hành li tâm 10 phút (4020 vòng/phút) để thu huyết tƣơng. Huyết tƣơng đƣợc trữ trong tủ đông -80°C cho đến khi phân tích mẫu.
19
Hình 9.Mẫu máu giữ lạnh trong suốt thời gian thu mẫu
3.1.2. Thí nghiệm nuôi tăng trưởng dài ngày
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm cũng lần lƣợt đƣợc bố trí vào 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với các mức nhiệt độ nhƣ thí nghiệm 1. Mật độ cá thí nghiệm là 51 con/bể. Cách thức thuần và nâng mức nhiệt độ đƣợc tiến hành tƣơng tự thí nghiệm ngắn ngày.
Cá đƣợc cho ăn 2 lần/ngày cho đến khi thỏa mản trong 1 giờ. Lƣợng thức ăn thừa ở buổi cho ăn (sáng và chiều) đƣợc vớt ra, đếm và xác định khối lƣợng; từ đó xác định đƣợc tổng khối lƣợng cá của bế ăn/ngày. Nƣớc thí nghiệm đƣợc định kỳ 1 tuần/lần thay khoảng 30% nƣớc để tránh gây biến động thay đổi nhiệt độ. Hệ thống lọc tuần hoàn và siphon đáy (nếu có cặn đáy) đảm bảo chất lƣợng nƣớc thí nghiệm.
Ghi nhận số liệu
Ở thời điểm bố trí thí nghiệm, 51 cá có kích thƣớc và khối lƣợng tƣơng đồng ngẫu nhiên đƣợc chọn để bố trí vào mỗi bể thí nghiệm. Tổng khối lƣợng của 51 cá đƣợc xác định bằng cân điện tử. Chiều dài trung bình của cá bố trí đƣợc xác định bằng cách đo ngẫu nhiên 10 cá/50 cá.
Ở thời điểm kết thúc thí nghiệm, số lƣợng cá còn lại trong bể, tổng khối lƣợng cá ở mỗi bể, chiều dài trung bình của cá thí nghiệm (đo 10 con/tổng số) đƣợc xác định để xác định các chỉ tiêu tăng trƣởng.
Trong suốt thời gian thí nghiệm thu các số liệu về yếu tố môi trƣờng (Nhiệt độ, Oxy, pH), thu 2 lần/ ngày vào buổi sang và buổi chiều ở thời điểm cho cá ăn. Cá
20
chết trong các bể thí nghiệm đƣợc ghi nhận số lƣợng, thời điểm chết và khối lƣợng của cá chết.
Lƣợng thức ăn cho cá ăn mỗi ngày của từng nghiệm thức đƣợc ghi nhận cẩn thận để tính toán lƣợng thức ăn cá ăn vào trong thời gian thí nghiệm. Cá đƣợc cho ăn một lƣợng thức ăn thỏa mản trong một giờ vào buổi sáng 8:00 đến 9:00 và buổi chiều 15:00 đến 16:00. Một giờ sau khi cho cá ăn, thức ăn thừa đƣợc vớt ra và đếm viên. Dựa vào số lƣợng viên thức ăn dƣ (sáng + chiều) và khối lƣợng 1 viên thức ăn ban đầu, tính đƣợc lƣợng thức ăn.
Thu mẫu
Cá đƣợc thu mẫu 02 đợt để xác định ảnh hƣởng dài hạn của nhiệt độ lên sự thay đổi nội tiết tố tăng trƣởng ở thời điệm 28 và 56 ngày thí nghiệm. Mỗi lần thu 03 cá/bể. Cách thu mẫu đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ ở thí nghiệm ngắn ngày.
3.2. Phƣơng pháp đo và xử lí số liệu
3.2.1. Phương pháp đo IGF-I
Nồng độ hormone IGF-I trong huyết tƣơng đƣợc định lƣợng theo phƣơng pháp miễn dịch men (ELISA-Enzyme-linked immunosorbent assay), bằ
ủa Đứ ế
Các bƣớc tiến hành:
Rút 50 µL dung dịch mẫu chuẩn, đối chứng hay mẫu thí nghiệm đã trung hòa pH cho vào mỗi giếng.
Cho 100 µL dung dịch Enzyme Conjugate cho vào mỗi giếng và trộn đều trong 10 giây và ủ ở nhiệt độ phòng trong 120 phút.
Trút bỏ hết dung dịch có trong mỗi giếng và rửa lại 3 lần bằng dung dịch rửa (Wash Solution). Ở lần rửa thứ 3, trút sạch hoàn toàn nƣớc trong giếng ra và để giếng thật khô.
Tiếp tục thêm vào 150 µL Enzyme Complex vào mỗi giếng và ủ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút.
Sau đó tiếp tục rửa lại nhƣ bƣớc rửa lần 1.
Cho thêm 100 µL dung dịch Substrate vào mỗi giếng và ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
21
Cuối cùng, thêm 100 µL Stop Solution vào mỗi giếng và đọc kết quả trong 10 phút ở bƣớc sóng 450nm.
3.2.2. Các chỉ tiêu tăng trưởng
Tỉ lệ sống (%) (survival rate-SR):
SR(%) = (số cá thể cuối thí nghiệm/số cá thể ban đầu) x 100 Tăng trọng (Weight gain):
WG = Wt-Wo
Tốc độ tăng trƣởng tuyệt đối trên ngày về khối lƣợng (Daily Weight Gain- DWG) (g/ngày):
22
Tốc độ tăng trƣởng tuyệt đối trên ngày về chiều dài (Daily Length Gain- DLG) (cm/ngày):
DLG (cm/ngày) = (Lt – Lo)/t
Tốc độ tăng trƣởng tƣơng đối (Specific Growth Rate-SGR): SGR (%/ngày) = 100x[Ln(Wt) – Ln(Wo)]/t Trong đó :
Wo: Khối lƣợng cá ban đầu. Wt: Khối lƣợng cá ở thời điểm t. Lo: Chiều dài cá ở thời điểm ban đầu. Lt: Chiều dài cá ở thời điểm t.
t: Thời gian nuôi.
Hệ số chuyển hóa thức ăn (Feed Conversion Ratio, FCR): Lƣợng thức ăn sử dụng (lƣợng cho ăn - lƣợng thừa)
FCR = --- (Khối lƣợng cá thu–khối lƣợng cá ban đầu) + Khối lƣợng cá chết
Chú ý: Khối lƣợng thức ăn thừa đƣợc xác định bằng cách đếm số viên thức ăn dƣ sau mỗi lần cho ăn (30 phút) để qui đổi ra khối lƣợng khô từ đó xác định đƣợc thức ăn cá đã dùng.
3.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, sai số chuẩn,so sánh phƣơng sai một nhân tố (One Way Anova) của các trung bình sai khác của các nghiệm thức bằng phép thử so sánh đa trị Tukey sử dụng phần mềm Minitab 16.2, với mức ý nghĩa α=0,05.
23
Chƣơng 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN 1. Điều kiện thí nghiệm và các yếu tố môi trƣờng
Nhiệt độ bể thí nghiệm đƣợc đo đạt hàng ngày và đƣợc điều chỉnh phù hợp với ngƣỡng nhiệt độ yêu cầu trong suốt thời gian thí nghiệm. Từ kết quả nghiên cứu cho thấy sự dao động các yếu tố môi trƣờng trong suốt thời gian thí nghiệm ở các bể diễn ra tƣơng đối ổn định, nghiệm thức thấp nhất 24,81 oC/buổi sáng, cao nhất là 35,72 oC/buổi sáng. Thí nghiệm đƣợc bố trí trong nhà trại thông thoáng, có mái che kiên cố, xung quanh đƣợc bao bọc bằng lƣới thép P40 và che chắn bằng lƣới nhựa, không khí thoáng mát nên nhiệt độ biến động không lớn giữa các thời điểm trong ngày. Nhiệt độ chênh lệch giữa sáng và chiều không đáng kể, dao động trong khoảng 1oC. Theo Boyd (1990), tốc độ thay đổi nhiệt độ khoảng 0,2
o
C/phút không sẽ ảnh hƣởng đến sinh lý cá, tuy nhiên, biên độ dao động nhiệt độ trong ngày thay đổi đột ngột từ 3-4 o
C có thể làm cá bị sốc nhiệt. Nhìn chung, yếu tố nhiệt độ môi trƣờng nƣớc thí nghiệm tƣơng đối ổn định, sự chênh lệch chỉ là 1oC giữa sáng và chiều, cá đã đƣợc thuần dƣỡng sẽ không bị sốc bởi điều kiện nhiệt độ thí nghiệm.
1. Các yếu tố môi trƣờng (Số liệu: trung bình ± độ lệch chuẩn)
Nhiệt độ pH
Nghiệm thức Số lần đo (n) Sáng Chiều Sáng Chiều
24 oC 102 24,81 ±0,92 25,19 ±0,79 8,04 ±0,53 8,16 ±0,44 Đối chứng 102 26,63 ±0,95 27,77 ±1,07 8,15 ±0,67 7,88 ±0,58 30 oC 102 29,80 ±1,27 29,52 ±0,40 8,31 ±0,65 8,19 ±0,70 32 oC 102 31,39 ±0,76 31,66 ±0,69 8,19 ±0,53 8,10 ±0,71 34 oC 102 33,89 ±1,37 34,82 ±1,29 8,00 ±0,51 7,97 ±0,59 36 oC 102 35,72 ±0,55 36,16 ±0,84 8,16 ±0,44 8,01 ±0,63
pH giữa các nghiệm thức có sự chênh lệch không lớn, buổi sáng dao động trong khoảng 8,04-8,31, buổi chiều dao động trong khoảng 7,88- 8,19, chênh lệch pH giữa sáng và chiều là không đáng kể. Theo Boyd (1990); Lê Văn Cát và ctv (2006); Nguyễn Chung (2008) cá tra phát triển tốt trong điều kiện pH 6,5-9,0, khi
24
pH < 6,5 sẽ ảnh hƣởng đến sự tăng trƣởng và phát triển của cá. Vì vậy yếu tố pH phù hợp với đặc điểm sinh học của cá tra trong suốt quá trình thí nghiệm.
Hình 10. Oxy hòa tan giữa các nghiệm thức (giá trị: trung bình±độ lệch chuẩn, các cột không cùng chữ cái thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (Tukey,
p<0.05))
Do sự thay đổi của nhiệt độ, oxy hòa tan ở các bể thí nghiệm là không đồng đều nhau mặc dù các bể thí nghiệm đƣợc sử dụng chung hệ thống sục khí và chế độ lọc tƣơng tự nhau. Theo Roberts and Vidthayanon (1991), cá tra là cá có cơ quan hô hấp phụ có khả năng hô hấp khí trời, có thể chịu đựng đƣợc điều kiện nuôi với nồng độ oxy thấp. Nồng độ oxy hòa tan trong các bể thí nghiệm tuy khác nhau, nhƣng đều lớn hơn 3mg/L, đảm bảo đƣợc nhu cầu oxy bình thƣờng của nhóm cá này.
Nhƣ vậy, từ kết quả trên cho thấy trong suốt quá trình nghiên cứu các yếu tố môi trƣờng đều đƣợc đảm bảo nằm trong giới hạn thích hợp cho sự phát triển, sinh trƣởng, phù hợp với điều kiện sống bình thƣờng của cá, và không gây ảnh hƣởng đến kết quả nghiên cứu. Sự khác biệt giữa các nghiệm thức bố trí và sự dao động giữa ngày và đêm là không đáng kể.
2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên tỉ lệ sống của cá tra
Nhìn chung , tỉ lệ sống ở các nghiệm thức đều cao. Trong đó, tỉ lệ sống ở nghiệm thức 27°C là cao nhất (98,52%), khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) đối với các nghiệm thức 30, 32, 34, và 36°C. Nghiệm thức 24°C có tỉ lệ sống thấp
a ab ab b c c 0 1 2 3 4 5 6 7
24oC Đối chứng 30oC 32oC 34oC 36oC
25
nhất là 70,37%, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) với các nghiệm thức còn lại (Hình 11).
Hình 11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên tỉ lệ sống của cá trong 56 ngày thí nghiệm (Số liệu: trung bình ± sai số chuẩn, các giá trị có cùng chữ cái thì
khác biệt không có ý nghĩa thống kê, Tukey, p<0,05)
Nhƣ vậy, nhiệt độ có những ảnh hƣởng nhất định đến sự sống và sinh trƣởng của sinh vật, cụ thể là cá tra. Cá tra là loài cá nƣớc ngọt, sống trong điều kiện tự nhiên ở Việt Nam, khu vực nhiệt đới gió mùa. Ở ĐBSCL, biên độ nhiệt độ dao động từ 25-32°C và nhiệt độ trung bình hàng năm là 27°C thích hợp cho việc nuôi cá tra. Nhƣ vậy kết quả nghiên cứu này phù hợp với quy luật chung của sinh lý động vật thủy sinh là mỗi sinh vật có một khoảng nhiệt độ thích hợp để sống bình thƣờng và sinh sản. Theo Nguyễn Nhân Minh 2013, tỉ lệ sống của ấu trùng cá chẽm cao khi nhiệt độ nƣớc ổn định ≥ 28°C, nhƣng khi nhiệt độ ≤ 26°C thì tỉ lệ sống và tăng trƣởng của ấu trùng sẽ thấp. Ở cá trê phi,sau 28 ngày ở 4 mức nhiệt độ khác nhau (22, 27, 32 và 37°C) và mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Kết quả cho thấy khi cá đƣợc xử lý ở nhiệt độ cao (37°C) tạo ra tỉ lệ đực cao hơn (89%) với tỉ lệ sống thấp (79%) (Ali and Mervat, 2009). Nhìn chung, qua 56 ngày nuôi ở các mức nhiệt độ khác nhau thì cá có tỉ lệ sống tƣơng đối cao, riêng nghiệm thức 24°C cá có tỉ lệ sống thấp nhất so với các nghiệm thức còn lại, nguyên nhân cá bỏ ăn trong suốt thời gian thí nghiệm nhân, khi nhiệt độ giảm quá thấp các hoạt động trao đổi chất của cơ thể cá bị dừng lại do hoạt động của enzim giảm, các phản
b a a a a a 0 20 40 60 80 100 120
24oC Đối chứng 30oC 32oC 34oC 36oC
26
ứng sinh hóa bị giảm hoạt dừng lại có thể dẫn đến hiện tƣợng cá chết (Đỗ Thị Thanh Hƣơng và Nguyễn Văn Tƣ, 2010).
3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự tăng trƣởng của cá tra
Tăng trọng của cá cao nhất ở mức 65,74g ở nghiệm thức có nhiệt độ 34°C, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) với các nghiệm thức các nghiệm thức có nhiệt độ thấp là 24, 27 và 300
C. Nghiệm thức 32 oC (48,85g) và 36oC (51,38g) cho kết quả tăng trọng khác biệt không có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức 34oC. Tăng trọng ở nghiệm thức 24°C (29,86g) là thấp nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê với các nghiệm thức khác (Hình 12)
Hình 12. Tăng trọng của cá sau 56 ngày thí nghiệm (giá trị: trung bình ±sai số chuẩn, các cột có không cùng chữ cái thì khác biệt có ý nghĩa thống kê,
Tukey, p<0,05)
Quá trình sử dụng và hấp thu thức ăn để xây dựng cơ thể đƣa đến kết quả là cơ thể tăng về kích thƣớc và trọng lƣợng, quá trình tăng trƣởng của cá bị ảnh hƣởng bởi nhiều yếu tố nhƣ môi trƣờng sống, mật độ, thức ăn, nhiệt độ…Trong đó, nhiệt độ nhiệt độ đƣợc xem là yếu tố ngoại cảnh ảnh hƣởng lớn đến quá trình sinh sản và phát triển của cá, ảnh hƣởng trực tiếp đến hoạt động sinh lí của cá. Theo Ngô Văn Ngọc và ctv, 2003 cho rằng: mỗi loài cá đều có khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự tăng trƣởng và phát triển. Hầu hết các loài cá nhiệt đới có khả năng chịu đƣợc nhiệt độ nƣớc cao hơn các loài cá ôn đới. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của các loài cá nhiệt đới là 24-32°C, tốt nhất là 26-32°C.
c b b ab a ab 0 10 20 30 40 50 60 70 80
24oC 27oC 30oC 32oC 34oC 36oC
27
Chiều dài của cá sau 56 ngày thí nghiệm cũng cho kết quả khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) giữa các nghiệm thức. Yếu tố nhiệt độ đã phân hóa sự khác biệt về tăng dài của cá tra thành hai nhóm là nhóm nghiệm thức 24, 27, 30°C và nhóm nghiệm thức 32, 34, và 36°C. Trong đó, nghiệm thức 34°C có sự tăng dài là lớn nhất so với các nghiệm thức còn lại đạt mức 4,73cm, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với nghiệm thức 32, 36°C, nhƣng có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức 24, 27, và 30°C. Bên cạnh các nghiệm thức có sự gia tăng cao về