in vitro của dược liệu
Nguyên tắc:
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên sự tạo thành acid uric từ xanthin nhờ xúc tác của enzym XO. Thí nghiệm được tiến hành dựa trên phương pháp của M. Umamaheswari và của Đái Thị Xuân Trang có điều chỉnh để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [9][52]. Nguyên tắc định lượng dựa trên phản ứng sau:
Xanthin oxidase
2 2 2 2 2
Xanthin + H O + O Acid uric + H O
Hoạt độ XO được xác định thông qua lượng acid uric tạo thành được đo ở bước sóng 295 nm ở 37o
C, pH 7,5 hoặc 8,0. Một đơn vị enzym được định nghĩa là tổng lượng enzym sản xuất ra 1 µmoL acid uric trong mỗi phút ở nhiệt độ 37ºC.
2.4.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym XO và cơ chất xanthin lên sự hình thành acid uric
Cách tiến hành:
Thử nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym XO và cơ chất xanthin lên sự hình thành acid uric được tiến hành tại bộ môn Dược lý- Dược lâm sàng, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
100mL xanthin 1000 mM được pha trong 10 giọt NaOH 1M, sau đó đem pha loãng trong dung dịch đệm phosphat (50 mM, pH 7,5) để được các nồng độ khác nhau. Enzym XO được pha loãng thành các nồng độ 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 và 0 U/ml trong dung dịch đệm phosphat (50 mM, pH 7,5) sau đó thêm vào phản ứng (nồng độ 0 U/mL được dùng để đối chứng). Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37°C trong 30 phút. Lượng acid uric tạo ra được xác định bằng cách đo ở bước sóng 295 nm. Thí nghiệm được bố trí theo bảng 2.1.
Bảng 2.1. Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym XO và cơ chất xanthin lên sự hình thành acid uric
Nồng độ Xanthin (X)
(mM)
Nồng độ Enzym XO (O) (U/ml)
0 (O1) 0,025 (O2) 0,05 (O3) 0,1 (O4) 0,2 (O5)
75 (X1) X1O1 X1O2 X1O3 X1O4 X1O5
150 (X2) X2O1 X2O2 X2O3 X2O4 X2O5
250 (X3) X3O1 X3O2 X3O3 X3O4 X3O5
500 (X4) X4O1 X4O2 X4O3 X4O4 X4O5
2.4.1.2. Thẩm định phương pháp thông qua đánh giá tác dụng của Allopurinol
Cách tiến hành:
Thử nghiệm Thẩm định phương pháp thông qua đánh giá tác dụng của Allopurinol được tiến hành tại bộ môn Dược lý- Dược lâm sàng, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
50g Allopurinol được pha loãng trong dung dịch đệm phosphat (50 mM, pH 7,5) để được các nồng độ khác nhau là: 0,05 µg/mL, 1,25 µg/mL, 2,5 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 12,5 µg/mL.
100 µL dung dịch mẫu Allopurinol, 300 µL dung dịch đệm phosphat 50 Mm có pH = 7.5, 100 µL dung dịch enzym XO (0,2 U/mL trong dung dịch đệm phosphat (pha ngay trước khi tiến hành phản ứng), 100 µL nước cất. Hỗn hợp này được ủ ở 37oC trong 15 phút, sau đó thêm 200 µL xanthin (0,15 mM) trong dung dịch đệm rồi ủ tiếp 30 phút. Dừng phản ứng bằng cách thêm 200 µL HCl 0,5M. Hỗn hợp phản ứng được đem đo độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 295 nm. Mẫu chứng được tiến hành tương tự nhưng dung dịch thử Allopurinol được thay bằng dung dịch đệm.