4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
2.2.2. Chế tạo màngCVK nạp thuốc Cur
2.2.2.1.Xây dựng đường chuẩn thuốc Cur
Sử dụng hệ thống quang phổ tử ngoại UV để ghi mật độ quang hấp thụ của thuốc Cur. Chuẩn bị mẫu chuẩn với các nồng độ khác nhau (ít nhất là 3 mẫu): Pha dung dịch Cur ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau: 0.05mg/ml; 0.1mg/ml; 0.15mg/ml; 0.2mg/ml; 0.3mg/ml. Sử dụng dung môi là etanol 96°. Đo UV ở bƣớc sóng 427nm (bƣớc sóng hấp thụ cực đại của Cur). Ghi kết quả thu đƣợc và dựng đƣờng chuẩn của mẫu với C% đƣợc trình bày theo bảng 2.2.
Bảng 2.2: Mật độ quang (OD) của dung dịch Cur ở các nồng độ C% (mg/ml) 5 10 15 20 25 30 OD427nm 0.868 ± 0.021 1.469 ± 0.042 2.058 ± 0.088 2.550 ± 0.047 3.113 ± 0.133 3,082 ± 0.088
Hình 2.2: Phƣơng trình đƣờng chuẩn Cur dung môi là etanol 96°
Với phƣơng trình đƣờng chuẩn là:
y = 0.1124x + 0.3287 R² = 0.9992
Trong đó: y: Giá trị OD tƣơng ứng với nồng độ x x: Nồng độ % Cur (mg/ml) R2: Hệ số tƣơng quan y = 11.239x + 0.3287 R² = 0.9992 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Đ ộ hấp th ụ qu an g (n m ) Nồng độ % Cur (mg/ml) OD427
Nạp Cur nạp vào màng CVK
Cho màng CVK vào 100ml dung dịch Cur 20mg (dung môi là etanol 96°) ở 2 trƣờng hợp trình bày trong bảng 2.3: Bảng 2.3: Các trƣờng hợp thí nghiệm Trƣờng hợp Kích thƣớc (cm) Độ dày (cm)
Điều kiện nạp thuốc của màng 1 8 0.7 - Không loại bỏ nƣớc, - Đặt ở điều kiện tĩnh, - Nhiệt độ phòng. 8 1 2 8 0.7 - Loại bỏ 50% nƣớc, - Lắc ở 180 vòng/phút, - Nhiệt độ phòng. 8 1
Xác định hàm lượng thuốc Cur được hấp thụ vào màng CVK.
Sau khoảng thời gian 1h, 2h lấy màng CVK ra xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ qua màng.
Dùng máy đo quang phổ UV - 2450 xác định lƣợng Cur trong CVK đã nạp thuốc.
Hiệu suất nạp thuốc vào màng CVK đƣợc tính theo công thức [36]:
EE (%) =
x 100% (1)
Trong đó: EE: Phần trăm thuốc nạp vào màng (%) Qt: Lƣợng thuốc lí thuyết (mg)
2.2.2.3. Phân tích thống kê
Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần để lấy trung bình mẫu và phân tích thống kê số liệu qua phần mềm Excel 2013 để phân tích phƣơng sai và xác định khoảng tin cậy. Tất cả các dữ liệu đƣợc trình bày theo giả định trung bình và độ lệch chuẩn “MEAN ± SD”. Những khác biệt đƣợc coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0.05 [39].
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu màng CVK và tinh chế màng
Để thu màng CVK có độ dày 0.7 - 1cm ta tiến hành thu từ dịch nuôi cấy tĩnh A. xylinum sau 10 - 13 ngày. Bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày nhƣ trên hình 3.1
Hình 3.1: Nuôi cấy màng CVK lên từ môi trƣờng HS
Màng CVK đƣợc nuôi cấy từ môi trƣờng HS sau khi tinh chế đáp ứng yêu cầu thể chất mềm mại, linh hoạt, dễ gấp mà không cần thêm một vật liệu dẻo nào, độ bền kéo và độ đàn hồi tốt, không bị khô khi để ngoài không khí. Hình ảnh màng CVK tinh chế đƣợc trình bày ở hình 3.2.
Màng CVK ở 2 độ dày 0.7cm và 1cm đƣợc trình bày nhƣ trên hình 3.3.
Hình 3.3: Thí nghiệm đo độ dày của màng
Kiểm tra độ tinh sạch của màng đƣợc trình bày trên hình 3.4. Trong đó:
Ống đối chứng có chứa glucose Ống đối chứng chứa nƣớc cất
Mẫu 1: Dịch thử và màng có độ dày 0.7cm.
Mẫu 2: Dịch thử và màng có độ dày 1cm
Hình 3.4: Thí nghiệm kiểm tra độ tinh sạch của màng
3.2. Màng CVK nạp thuốc Curcumin
Màng CVK sau khi tinh chế đƣợc nạp thuốc Cur (20%). Thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ ở hình 3.5. Sau khi nạp thuốc ta thu đƣợc màng CVK ở các trƣờng hợp đƣợc trinh bày trên hình 3.6.
Hình 3.5: Nạp thuốc ở các trƣờng hợp
TH1: Màng không đƣợc loại bỏ 50% nƣớc, đặt ở điều kiện tĩnh TH2: Màng đƣợc loại bỏ 50% nƣớc, lắc ở 180vòng/phút
TH 1
Hình 3.6: CVK thu đƣợc sau khi hấp thụ thuốc 3.3. Khối lƣợng thuốc nạp đƣợc vào màng CVK
Khối lƣợng thuốc nạp vào màng CVK đƣợc tính theo nghiên cứu của TS. Nguyễn Xuân Thành và cộng sự [36].
Sử dụng máy đo quang phổ UV - 2450 ta tính đƣợc giá trị OD trung bình của dung dịch Cur 20%. Các giá trị OD427nm của thuốc giảm dần và sau 2h thì không đổi ở cả hai độ dày màng với cả 2 trƣờng hợp. Chứng tỏ lƣợng thuốc hấp thụ vào màng đã đạt cực đại. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Giá trị trung bình OD của dung dịch Cur khi ngâm màng CVK tại 2h (n = 3) Trƣờng hợp Độ dày màng (cm) Giá trị OD427nm 1 0.7 1.879 ± 0.015 1 1.948 ± 0.024 2 0.7 1.798 ± 0.016 1 1.851 ± 0.013 TH1 TH2
Từ giá trị OD thu đƣợc ở bảng 3.1, thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn của Cur ta tìm đƣợc nồng độ Cur (C%) trong dung dịch và xác định đƣợc khối lƣợng Cur có trong dung dịch (Qd), lấy khối lƣợng Cur có trong dung dịch ban đầu trừ đi lƣợng thuốc còn lại trong dung dịch ta đƣợc khối lƣợng Cur hấp thụ vào màng CVK (mht), tiếp tục lấy khối lƣợng Cur đƣợc hấp thụ vào màng BC thay vào công thức (1) ta thu đƣợc tỷ lệ thuốc Cur đƣợc hấp thụ vào màng CVK. Khối lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ vào màng CVK, tỷ lệ hấp thụ và cƣờng độ hấp thụ thuốc của màng BC đƣợc trình bày nhƣ trong bảng 3.2.
Bảng 3.2: Lƣợng thuốc hấp thụ Cur qua màng CVK ở TH1 (n = 3) Độ dày màng (cm) Qt (mg) y Qd (mg) mht Thể tích màng (cm3) Cƣờng độ hấp thụ màng (mg/cm3) EE (%) 0.7 20 1.879 ± 0.015 13.793 ± 0.004 6.207 ±0.0013 35.168 0.177 ± 0.016 31.036 ± 0.0023 1 20 1.948 ± 0.024 14.407 ± 0.007 5.593 ± 0.0015 50.24 0.111 ± 0.021 27.967 ± 0.0025
Bảng 3.3: Lƣợng thuốc hấp thụ Cur qua màng CVK ở TH2 (n = 3) Độ dày màng (cm) Qt (mg) y Qd (mg) mht Thể tích màng (cm3) Cƣờng độ hấp thụ màng (mg/cm3) EE (%) 0.7 20 1.798 ± 0.016 13.072 ± 0.003 6.928 ±0.0013 35.168 0.197 ± 0.013 34.640 ± 0.0019 1 20 1.851 ± 0.013 13.544 ± 0.004 6.456 ± 0.0015 50.24 0.129 ± 0.012 32.282 ± 0.0016
(a) (b)
Hình 3.7: Hiệu suất hấp thụ Cur ở 2 độ dày màng của 2 trƣờng hợp (a) Màng không đƣợc loại bỏ 50% nƣớc, đặt ở điều kiện tĩnh (b) Màng đƣợc loại bỏ 50% nƣớc, lắc ở 180vòng/phút
Từ bảng 3.2, bảng 3.3 và hình 3.7 kết hợp so sánh 2 số trung bình mẫu nhỏ [9], ta thấy:
-Xét cùng độ dày màng và khác điều kiện hấp thu: màng ở TH2 hấp thụ thuốc Cur tốt hơn ở TH1. Cùng độ dày là 0.7cm nhƣng ở TH2 tỷ lệ hấp thụ thuốc đạt 34.64% cao hơn TH1 là 31.036%. Nhƣ vậy, có thể coi ở điều kiệu hấp thụ với màng đƣợc loại bỏ 50% nƣớc và đặt trên máy lắc với vận tốc 180 vòng/phút lƣợng thuốc hấp thụ vào màng tốt hơn (số liệu này có ý nghĩa thống kê với P(T<=t) two-tail = 0.0432 < 0.05). Sự chênh lệch cũng thấy đƣợc khi so sánh cùng loại màng khác nhau về điều kiện hấp thụ thuốc của CVK. Kết quả này của chúng tôi cũng tƣơng tự kết quả nghiên cứu của Điều này có thể giải thích rằng: khi loại bỏ 50% nƣớc của màng và chế độ lắc tạo động lực cho thuốc đƣợc khuếch tán vào các lỗ nhỏ trong màng CVK tăng lên, dẫn đến lƣợng thuống đi vào màng đƣợc nhiều hơn.
9.0 14.0 19.0 24.0 29.0 34.0 0.7cm 1cm T ỷ lệ t h u ốc h ấp thụ ( % ) Trƣờng hợp 1 0.7cm 1cm 9.0 14.0 19.0 24.0 29.0 34.0 39.0 0.7cm 1cm T ỷ lệ th u ốc h ấp th ụ (% ) Trƣờng hợp 2 0.7cm 1cm
-Xét khác độ dày màng và cùng điều kiện hấp thụ: màng có độ dày 0.7cm hấp thụ thuốc Cur đạt 34.64% cao hơn màng 1cm là 32.282%. Nhƣ vậy, có thể coi ở độ dày màng nhỏ hơn thì lƣợng thuốc hấp thụ vào màng tốt hơn (số liệu này có ý nghĩa thống kê với P(T<=t) two-tail = 0.0026 < 0.05). Sự chênh lệch cũng thấy đƣợc khi so sánh cùng loại màng cùng môi trƣờng hấp thụ thuốc của CVK. Kết quả này của chúng tôi cũng tƣơng tự kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Xuân Thành [36]. Vì vậy, màng CVK có độ dày 0.7cm có khả năng hấp thụ thuốc Cur vàng màng tốt hơn. Điều này gó thể giải thích rằng: màng dày hơn thì đƣờng đi của thuốc vào màng dài hơn nên trong cùng khoảng thời gian hấp thụ thì màng có độ dày 0.7cm hấp thụ thuốc với tỷ lệ cao hơn.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1.Kết luận
-Hiệu quả hấp thụ thuốc Cur của màng CVK tốt hơn trong điều kiện màng đƣợc loại bỏ 50% nƣớc và lắc ở điều kiện 180 vòng/phút, ở thời gian 2h ở màng có cùng kích thƣớc nhƣng đặt trong điều kiện thƣờng (màng dày 0.7cm là 34.64% > 31.036%).
-Màng có độ dày 0.7cm hấp thụ thuốc Cur tốt hơn màng có độ dày 1cm có giá trị lần lƣợt là 34.64% > 32.282%.
2.Kiến nghị
-Từ khả năng hấp thụ sẽ nghiên cứu tiếp khả năng giải phóng của thuốc Cur trên hệ thống mô phỏng đƣờng uống hoặc đƣờng da.
-Tiếp tục tiến hành khảo sát khả năng hấp thụ thuốc trên một số môi trƣờng lên men CVK khác nhau.
-Tiếp tục tiến hành nghiên cứu đề tài này trên động vật thí nghiệm để đánh giá sinh khả dụng của thuốc từ hệ thống CVK mang thuốc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1.Kỳ Anh, “Tác dụng thần kỳ của củ gừng và nghệ phòng và trị bệnh”, Nxb Đà Nẵng, Hồ Chí Minh năm 2008.
2.Dƣơng Thị Hồng Ánh, Phạm Văn Giang, Nguyễn Trần Linh, “Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano curcumin bằng phương pháp nghiền bi kết hợp với đồng nhất hóa tốc độ cao”,Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, số 1/2014, nghiên cứu dƣợc thông tin thuốc.
3.Võ Công Danh, Nguyễn Thúy Hƣơng, (2013), “Lọc nước uống nhiễm khuẩn bằng màng Bacterial celluose cố định bạc Nano”, Tạp chí Đại học Công Nghiệp, 22 - 30.
4.Trịnh Hoàng Dƣơng, Hà Diệu Ly (2011), “Chiết xuất Curcumin từ củ nghệ vàng (Rhizoma Curcumae longae) và xây dựng bộ dữ liệu chuẩn của curcumin để thiết lập chất chuẩn chiết từ dược liệu”, Viện kinh nghiệm Thuốc TP. Hồ Chí Minh, số 424, 26-29.
5.Đặng Thị Hồng (2007), “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học (CVK)”, Luận văn thạc sỹ Sinh học ĐHSP Hà Nội.
6.Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006), “Nghiên cứu các đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng”. Tạp chí Dƣợc học số 361/2006, trang 18-20.
7.Phan Minh Liêm, “Curcumin ức chế kháng thuốc và di căn của tế bào ung thư”.
8.Đỗ Tất Lợi (2004), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, Nxb Y học, 227 - 230.
9.Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Văn Phong (2013), “Phương pháp nghiên cứu sinh lý thực vật”, NXB ĐHQGHN.
10.Đinh Thị Kim Nhung (2012), “Nghiên cứu vi khuẩn A. xylinum tạo màng bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 50 (4), 453 - 462.
11.Đinh Thị Kim Nhung (2012), “Nghiên cứu thu nhận màng cellulose từ vi khuẩn Acetobacter, ứng dụng trị bỏng”, đề tài trọng điểm cấp Bộ giai đoạn 2010 - 2012.
12.Nguyễn Văn Thanh (2006), “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylium”, đề tài cấp Bộ, Bộ Y tế.
13. Bùi Thanh Tùng, Phan Kế Sơn, Phạm Thị Minh Huệ, Nguyễn Thanh Hải (2016), “Curcumin PEG hóa và triển vọng ứng dụng”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dƣợc, Tập 32, Số 1,1-11.
14.Nguyễn Thị Thùy Vân (2009), “Nghiên cứu đặc tính sinh học và khảnăng tạo màng bacterial cellulose của vi khuẩn A. xylinum phân lập từ một số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam”, Luận văn thạc sỹ sinh học, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội.
Tài liệu nƣớc ngoài
15. Aggarwal B. B.; Shishodia S. (2006). “Molecular targets of dietary agents for prevention and therapy of cancer”. Biochemical Pharmacology (Elsevier) 71 (10): 1397-1421.
16. Aggarwal BB, Harikumar KB, (2009), “Potential therapeutic effects of curcumin, the anti - inflammatory agent, against neurodegenerative, cardiovascular, pulmonary, metabolic, autoimmune and neoplastic diseases”, Int J Biochem Cell Biol; 41 (1): 40-59.
17. Almeida I.F. et al. (2014), “Bacterial cellulose membranes as drug delivery systems: An in vivo skin compatibility study”, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 86(3), 332 - 336.
18. Altaf S. Darvesh et al (2012), “Curcumin and liver cancer: a review”, Curr Pharm Biotech, 13, 218-228.
19. Anand et al. (2007), “Bioavailability of Curcumin: Problems and 36 Promises”, Molecular Pharmaceutics, Vol. 4, No. 6, 807-818.
20. Armando J. D. et al. (2014), “Do bacterial cellulose membranes have potential in drug delivery systems”, Expert Opin,136 - 142.
21. Beevers CS, Chen L, Liu L, Luo Y, Webster NJ, Huang S (2009),
“Curcumin disrupts the Mammalian target of rapamycin-raptor complex”, Cancer research 69 (3),1000.
22. Bharat et al (2005), “chapter 23 Curcumin Drived from Turmeric (Curcuma longa): a Spice for All Seasons, Phytopharmaceuticals in CancerChemoprevetion”, pages 350 - 387.
23. Bhavana V. et al (2016), “Study on the drug loading and release potential of bacterial cellulose”, Cellulose Chem. Technol, 50(2), 219 - 223.
24. Helenius G. et al. (2006), “ In vivo biocompatibility of bacterial cellulose”, J. Biomed. Mater Res, 76A,431 - 438.
25. Huang L. et al. (2013), “Nanocellulose 3D networks as controlled release drug carriers”, J. Mater. Chem. B., 1(23), 2976 - 2984.
26. I.Stankovic, “Curcumin”, 2004
27. Jantarat C. (2013), “Bioavailability enhancement techniques of herbal medicine: A case example of curcumin”, International J Pharmacy and Pharmaceutical Sci (5), 493.
28. Klemm D. et al. (2009), “Nanocellulose materials - different cellulose, different functionality”, Macromol. Symp, 280, 60-71.
29. Kramer F. et al (2006) Nanocellulose polymer composites as innovative pool for (bio)material development. Macromol Symp 244:136 - 148.
30. Kunihiko W., Mari T. (1998), “Structural features and properties of bacterial cellulose produced in agitated culture”, Cellulose 5, 187 - 200.
31. Li X, Li Z, Zheng J, Shi Z, Li L (2012), “Yeast extract promotes phase shift of bio-butanol fermentation by Clostridium acetobutylicum ATCC824 using cassava as substrate”, Bioresour. Technol, 125:43-51.
32. Lima, F..MT, Pinto, FCM, Andrade-da-Costa, BL.S. et al (2017), “Biocompatible bacterial cellulose membrane in dural defect repair of rat”, J Mater Sci: Mater Med (2017) 28: 37.
33. Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang, Liming Zhang, Guang Yang (2013), "Nano - cellulose 3D - networks as controlled - release drug carriers", Journal of Materials Chemistry B, 1(23), 2976 - 2984.
34. Mohammadkazemi F., K. Doosthoseini, M. Azin (2015), “Cellulose”,
Chem. Technol, 49, 455.
35. Muhammad M.A. et al. (2014), “A review of bacterial cellulose based drug delivery systems: their biochemistry, current approaches and future prospects”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 66, 1047 - 1061. 36. Nguyen T. X. et al. (2014), “Chitosan-coated nano-liposomes for the oral
delivery of berberine hydrochloride”,NJ. Mater. Chem. B., 2, 7149 - 7159. 37. Pandey MK, Kumar S, Thimmulappa RK, Parmar VS, Biswal S,
Watterson AC (2011), “Design, synthesis and evaluation of novel PEGylated curcumin analogs as potent Nrf2 activators in human bronchial epithelial cells”, European Journal of Pharmaceutical Sciences 43(1) 16.
38. Pavaloiu R.D et al (2014), “Use of Bacterial Cellulose as Reinforcement Agent and as Coating Agent in Drug Release Applications”, REV. CHIM. (Bucharest), 65(7): 852 - 855.
39. Pinto R. J. B. et al. (2009), “Antibacterial activity of nanocomposites of silver and bacterial or vegetable cellulosic fibers”, Acta Biomater, 5, 2279 - 2289.
40. Schramm M, Hestrin S (1954), “Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum”, J Gen Microbiol 11:123-129. doi:10.1099/00221287-11-1-123.
41. Sharma C et al. (2006) “Curcumin down regulates smokeless tobacco - induced NF - κB activation and COX - 2 expression in human oral premalignant and cancer cells”, Toxicology, 228(1):1-15
42. Shukla P. K., Khanna V. K., Ali M. M., Khan M. Y., Srimal R. C. (06/2008), “Anti - ischemic effect of curcumin in rat brain ”, Neurochem Res.
43. Silva N. H. C. S. et al. (2014), “Topical caffeine delivery using