Quy trình kỹ thu t phân tích đa hình di truyền tại hai vị trí 6340 và 7853 của gen

COX-1/COX-2 ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng 1. Giới thiệu

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những bệnh ung thư phổ biến với tỷ lệ tử vong cao trên thế giới. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới năm 2012, trên thế giới có 1,3 triệu ca mắc với gần 700 ca tử vong (globocan, 2012). UTĐTT là một bệnh có thể phát hiện và chữa trị hiệu quả nếu được phát hiện ở giai đoạn sớm, tuy nhiên hiệu quả điều trị sẽ giảm ở những giai đoạn muộn. Do đó, các chỉ thị sinh học chẩn đoán sớm ung thư có ý nghĩa rất quan trọng đối với việc chữa trị và k o dài thời gian sống cho bệnh nhân UTĐTT.

Bào quan ty thể có hệ gen riêng và nhân bản độc lập với hệ gen nhân. Năm 1981, Anderson và cs đã công bố trình tự và cấu trúc của hệ gen ty thể người (Anderson và cs, 1981). ADN ty thể người tồn tại ở dạng mạch vòng, sợi đôi, có kích thước 16.569bp, bao gồm 37 gen mã hóa cho 2 phân tử rRNA (12S, 16S), 22 phân tử tRNA và 13 phân tử protein thuộc các phức hợp của chuỗi hô hấp.

Gen cytochrome c oxidase I (COX-1) và gen cytochrome c oxidase II (COX-2) được định vị trên sợi nặng của ADN ty thể nằm từ vị trí nu 5904 đến 7455 (gen COX-1), từ vị trí nu 7586 đến 8269 (gen COX-2). Gen COX-1 và COX-2 mã hóa cho sản phẩm tương ứng là cytocrome c oxidase I và cytocrome c oxidase II là hai enzyme quan trọng thuộc phức hệ IV của chuỗi hô hấp. Cytocrome c oxidase I và II tham gia vận chuyển điện tử của quá trình phosphoryl hóa oxy hóa trong ty thể (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/).

Theo dữ liệu thống kê trên ngân hàng gen ty thể MITOMAP có rất nhiều đột biến sôma xảy ra trên gen COX-1 đã được công bố được tìm thấy trong nhiều loại bệnh khác nhau trong đó các biến đổi xảy ra khá phổ biến ở tế bào UTĐTT và các bệnh liên quan đến trực tràng (https www.mitomap.org). Trên đối tượng UTĐTT , theo nghiên cứu của Chihara và cs trên 10 dòng tế bào UTĐTT, bằng phương pháp PCR-RFLP và giải trình tự sản phẩm PCR từ 28 cặp mồi thiết kế gối lên nhau đã tìm được rất nhiều biến đổi trong đó có biến trên gen COX-1, có một số biến đổi đáng quan tâm như biến đổi tại vị trí 6709. Đây là sự biến đổi không đồng nghĩa làm thay đổi nucleotit G thành nucleotit A tại vị trí 6709, biến đổi tại vị trí 6709 làm thay đổi axit amin G thành E tại vị trí 269. Biến đổi này có khả năng làm thay đổi hình dạng của protein - sản phẩm của gen COX-1 đặc biệt là thay đổi cấu trúc xoắn α thứ cấp từ đó có thể ảnh hưởng đến chức năng của phân tử protein này. Ngoài ra kết quả

30 giải trình tự còn chỉ ra một số biến đổi khác trên gen COX-1 như tại vị trí 5973 biến đổi G giải trình tự còn chỉ ra một số biến đổi khác trên gen COX-1 như tại vị trí 5973 biến đổi G thành A và làm thay đổi axit amin A24T và biến đổi tại vị trí 6146 không làm thay đổi axit, biến G7979A ở gen COX-2 (Chihara và cs, 2011).

2. Nguyên lý

Phương pháp xác định đa hình di truyền tại hai vị trí 6340 và 7853 thuộc gen O -1 v COX-2 đều dựa vào phản ứng PCR sử d ng 2 cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để nhân đoạn ADN dài 161 bp của gen COX-1 và 472 bp của gen COX-2 ty thể. Sản phẩm PCR của gen COX-1, COX-2 được phân cắt bằng enzyme giới hạn BccI và HincIItương ứng để nhận biết vị trí có biến đổi. Sau đó sản phẩm phân cắt bằng enzyme giới hạn được điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide, nhuộm ethidium bromide và quan sát các băng điện di dưới ánh sáng UV (ánh sáng tử ngoại). Đối với gen COX-1, trong trường hợp tại vị trí 6340 là nucleotide C thì enzyme BccI sẽ cắt ADN thành 2 đoạn có kích thước 128 bp và 33bp. Trong trường hợp tại vị trí 6340 là nucleotide T thì enzyme sẽ không cắt nên sản phẩm sau khi cắt cho một băng 161 bp. Đối với gen COX-2, trong trường hợp tại vị trí 7853 là nucleotide A thì enzyme HincII sẽ cắt đoạn ADN có kích thước 472 bp thành hai băng có kích thước 257 bp và 215 bp, trong trường hợp tại vị trí 7853 là nucleotide G thì enzyme sẽ cắt đoạn ADN có kích thước 472 bp thành ba băng có kích thước 113, 144 bp và 215 bp.

3. Thiết bị, nguyên liệu và sinh phẩm

- Thiết bị: Máy PCR, máy ly tâm tốc độ thấp (spin down), máy ly tâm lạnh 15.000 v phút, buồng điện di gel agarose và nguồn điện di tương ứng, buồng thao tác vô tr ng, thiết bị ch p ảnh gel điện di và các thiết bị cơ bản khác.

- D ng c : pipet, đầu hút 10µl, 200µl và 1000µl; ống nhựa 0,2ml để làm phản ứng PCR và các thiết bị khác.

- Mẫu phân tích: mẫu mô (100mg mô tươi, máu (2-3ml) máu chống đông bằng EDTA), Mẫu được bảo quản ở -80oC ngay sau khi lấy mẫu.

- Kít tách chiết ADN tổng số QIAamp ADN Mini Kit (QIAGEN, Đức) và GeneJET Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ).

- Hot Start 2X Master Mix (NEB, Mỹ).

31

Bảng 1. Các cặp m i d ng trong nghiên cứu

Tên m i Gen đích/vị trí quan tâm Kích thước sản phẩm PCR (bp) Trình tự m i xuôi (5’-3’) M i ngược (5’-3’) COX-1.1 COX-1/ C6340T 161 TCC CTC TCT CCT ACT CCT GTT C

CTA AGA TAG AGG AGA CAC CTG CTA COX-2.1 COX-2/ G7853A 472 GAA GAA GGT GGT GTT GAG GTT G CCC TCT CTC CTA CTC CTG CTC

Bảng 2. Enzyme giới hạn d ng trong nghiên cứu

Tên enzyme

Trình tự nhân biết Vị trí đích (gen)

Sản phẩm c t

Biến đổi Không biến

đổi HincII 5’-GTY↓RAC-3’ R=G, A; Y=T, C G7853A (COX-2)  257 bp và 215 bp  113 bp, 144 bp và 215bp BccI 5’CCATC(N4) ↓3' C6340T (COX-1)  161bp  128bp và 33bp

4. Các bước của quy trình

Quy trình kỹ thuật phân tích đa hình di truyền tại hai vị trí 6340 và 7853 của gen

COX-1, COX-2 ty thể bằng phương pháp PCR-RFLP đều được tiến hành theo các bước sau:

Bước 1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu bệnh phẩm (máu, mô), ác đ nh nồng độ ADN tổng số:

Tách chiết ADN tổng số từ mô bằng kit QIAamp DNA Mini Kit của hãng Qiagen. Tách chiết ADN tổng số từ máu bằng kit GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit của hãng Thermo Scientific.

Các bước thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Sau khi kết thúc bước 1 sẽ thu được mẫu ADN tổng số, mẫu này được d ng để làm khuôn cho phản ứng PCR ở bước 2.

Bước 2. Thực hiện phản ứng PCR

32 Bảng 3.Các thành phần của phản ứng PCR Bảng 3.Các thành phần của phản ứng PCR Thành phần phản ứng Thể tích (µl) N ng độ cuối c ng Ống TN1 Ống TN2 Ống ĐC+ Ống ĐC- Master Mix 2X 6,25 6,25 6,25 6,25 1X Primer F (10-5M) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,4 µM Primer R (10-5M) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,4 µM PA+ 0 0 2,0 0

ADN khuôn Ph thuộc nồng độ ADN tổng số của mẫu Ph thuộc nồng độ ADN tổng số của mẫu 0 0 2 ng/ µl H2O Vừa đủ Vừa đủ 3,25 5,25 Tổng thể tích 12,5 12,5 12,5 12,5

PA+: các Pl smid m ng đoạn ADN 161 bp hoặc 472 bp với dạng bình thường và dạng biến đổi c gen COX-1 hoặc COX-2 ty thể.

Trộn đều bằng pipet. Ly tâm nhẹ. Đặt ống phản ứng vào máy PCR. Thiết lập chu trình nhiệt như sau:

Bảng 4. Điều kiện phản ứng PCR đối với các cặp m i

Tên mồi Nhiệt độ biến tính

thời gian Nhiệt độ gắn mồi thời gian Nhiệt độ k o dài chuỗi thời gian Số chu kỳ lặp lại COX-1.1 940 C: 30 giây 560C: 30 giây 680C: 45giây 35 COX-2.1 940 C: 30 giây 560C: 30 giây 680C: 45giây 35

Bước 3. Điện di và phân tích kết quả c phản ứng PCR

- Điện di trên gel agarose 2%, hoặc gel polyacrylamide nhuộm ethidium bromide và quan sát kết quả trên bàn soi đ n UV (ánh sáng tử ngoại).

- Quan sát hình ảnh gel điện di để xác định kết quả của phản ứng PCR:

 Trong ống phản ứng TN1, TN2 và ĐC+ luôn luôn thấy xuất hiện băng ADN 161bp hoặc 472 bp t y theo mồi.

33

Bước 4. Phân tích RFLP

Sử d ng enzyme giới hạn Hinc II và BccI để phân cắt sản phẩm PCR thu được. D ng pipet hút các thành phần của phản ứng vào trong ống 0,2ml theo bảng 5 sau:

Bảng 5.Các thành phần của phản ứng c t ADN bằng enzyme giới hạn HincII /BccI

Thành phần Thể tích (µl) 10X FastDigest® buffer 1,5 Sản phẩm PCR (~0.2 µg) 5,0 FastDigest® enzyme BccI/HincII 0,5 Nước Bổ sung đến đủ 15 l

Hỗn hợp được trộn đều bằng pipet, ly tâm nhẹ, ủ 5-10 phút trong bể ổn nhiệt ở 370