3. Kết qưả và thảo lu àn
3.5 Sự phân giải 2,4D
9 4D là một tronơ chất trừ cỏ dai có cơ chế tác dung theo kiểu bắt chước hoat động cùa auxin nhir IAA. Lơi dung đác tính kích thích sinh trương thục vậi.nhiéu neuời trồng rau ờ nước ta đã phun 2.4D với Iiéu lucmg tháp khiến rau trở nén xanh non »iả tạo đánh lừa người tièu đùng. Tuy nhiên, cũng nhu các chất chlorophenoxy khác 2 4D là chất độc đối với con người. Nhiều vu ngộ dộc rau do phun 2.4D dã xay ra ở nước ta. Thèm vào đó. thời gian tư phán huỷ cua 2.4D kéo dài tới 3 tháng [91- Nhu vậy cũng có nghía là dư lượng chát diệt co này tổn tại trong rau và đ í t canh tác là vấn đề rất đáng lo ngại. Tuy chua sưu tím được tài liệu vé khả năng phân giải 2.4D của A z o t o b a a e r nhưng chúng tô, đã nhân đuoc nhũng bà, báo v.ét vé khả
năng phan giai TCP cùa loa, vi khuẩn này. Xuất phát ,ừ co sá dô chú^g tó, dậ dặt
thí nghiêm tìm hiểu kha nãng phán giải 2.4D cua các chung A :o,obac,er phân ạp đưoc Chủng 86.2 có một số đãc tính giông như ở A.chroococaim và có kha nâng
, _ - Lo n 7 m f . Ma là n ơuổn c a c b o n d uy nhất được sừ dun g
Hình 6 Lưa chon các chủng có khả nãng sinh trường trên MT B có bỏ sung 200 mg 2,4D/lít
Về khả năng phân °iải 2,4D thương phẩm của chủng 86.2 chúng tôi nhận thày với ham ĩư ớ n g 2 0 0 m 2 . 4 D là nguồn cacbon duy”nhất các chủng đều sinh trường
ham U g u ^ ^ tao điều klẻn tốt cho tế bào phát triển
27 7 145 8: 156.9 mg/Ut. Phó h íp phu của 2 .4 0 tr o n g c ác m iu „uô ci;y quén.rén i ẵ bị tử n g oai - khá biến - hóng ngoa, gán đuoc trình bay a các hình 7a. 7b. 7c. 7d.
ĩ ũ í , , ®
Wavelength (nfnj
Hình 7b. Đ ô hấp phu của 2.4D trong mẫu nuôi cấy có bổ sung glucoza 5g/l (hàm lươn2 2.4D còn lai là 179.5mg/l)
H ình 7c. Đ ộ hấp phu củ a 2.4D trong m ẫu nuôi cấy có bổ sung glucoza 10g/l (hàm lượng 2,4D còn lại là 127,7mg/l)
Hình lá . Độ hấp phu cua 2.4D trong mẫu nuôi cấy có bô sung glucoza 20g/I (hàm lương 2,4D con lậi lã lo6.9mg/l)
Q ua các kết quả trên chúng tôi nhân thấy chùng 86.2 có khả năng phân giải 2.4D. Khi 10 g/1 glucoza được thèm vào môi trường, lương 2.4D còn sót lai là thấp
nhất. Tuy hoạt tính không mạnh như ở các chi Pseudomonas, Alcaligenes... nhưng
đây là m ột đạc tính quý của chủng Azotobacter mà chúng tôi phân lập được.
Đê chứng minh sự có mặt của các chất kích thích sinh trường thực vật có trong dịch nuôi Azotobacter, chúng tôi đã tiến hành các thừ nghiệm sinh hoc (biotest) tại Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam. Kết quả đươc trình bày ở các mục dưới đây:
3.6. Ảnh hường của dịch nuôi đến sự nẩy mầm của hạt nơỏ
Sau khi xư lý và ngâm ủ với dịch nuòi cấy pha loãns 5%, chúns tõi nhận thâv dịch nuôi các chủng 86.2, 76.1, 20.2 đều kích thích sự nảv mầm cua hạt naô (báng 7 và hình 8). Với ngô lai ĐK.888 tỷ lệ nảy mầm tãng từ 8,57 đến 14,29% so VỚI đối chứng không ngâm ủ với dịch vi khuẩn. Tỷ lệ nảv mầm ờ nsô tẻ p . l l tâng 5.71%. Đặc biệt ở chủng 86.2 làm tãng sự nảv mầm của hạt naò lai ĐK.888 lẽn 2.86% so với chủng AT. 19.
Bảng 7. Ảnh hưởng của dich nuòi Azotobacter spp.
đến sự nảy mám của hat ngò.
Chủng Tý lệ nảy mầm (%) Ngỏ lai ĐK.888 Ngỏ tẻ p.l 1 Đối chứng (H20 ) 48.57 94.29 86.2 62,86 100 76.1 57,14 100 20.2 60.00 100 AT. 19 60.00 100 26
86.2 Đối chứng AT. 19
Hình 8. Anh hưởng của Azotobacter lên sự nảy mầm của hạt ngỏ lai ĐK. 888
3.7. Nâng SU3Í va chíit luợng T3U CUI trang khi đươc bón thẻm Ázotobocter sp
Thí nghiệm được tiên hành ở qui mô chậu vại tại Viện khoa học kĩ thuật nòn° nghiệp Việt Nam. Ngoài nền phàn NPK. mỏi châu đươc bón thèm 107 CFU
Azotobacter sp. Sau 45 ngày, nãng suất cũng như chất lương rau cai trắng đươc kiếm tra. Kết quả được nêu trong bảnơ 8, 9 và hình 9.
Bảng 8. Năng suất rau cải tráng khi được bón thèm Azotobacter sp.
1 — 1
Vu đông xuân Vụ hè thu
Số ' Khối lươn2 Tích Số Cao Khối lượn,2 Tích luv
lá/chàu tươi thân lá luv chất lá/chàu càv tươi thân lá chất khò Chủng (g/chậu) khỏ (%) (cm) (g/chậu) (%) Đối chứng 49,0 90.2 5.86 33.3 ỉ 22.5 108.3 5.81 86.2 53,7 121,9 6.63 34.7 23.3 126.7 6.33 76.1 49.0 141.5 6,33 35.3 22.4 110.0 6.25 ^ 20.2 49,7 110.0 5.98 33,0 22.6 120.0 6.02 AT. 19 1 50.3 1 1 121.9 6.32 33.7 23.6 108.7 6.55
ở cả hai vụ đông xuân và hè thu, công thức bón chúng 86.2. 76.1. 20.2 đéu cho nang suất cạo t o n công thức đối chứng (không bón A zo 'o b a a en và
đưcng yái cflng thức bón chùng AT. 19 (chủng đôi chứng). Chất luong rau cãi , z
được bón thêm A zotobacter sp. được trình bày ở bản<7 9
Bảng 9. Chất lượng rau cải tráng được bón thèm Azotobacter sp.
Chủng
Vụ đông xuân Vụ hè thu
Đường tổng số(%) Vitamin c (mg/100g) N03- (mg/kg) Đường tổng số (%) Vitamin c (mg/100g) N 0 3- (ms/kg) Đối chứng 0,92 70,37 2,745 0,96 62.91 2,270 86.2 1,04 78,17 2,095 1.36 64,52 1.908 76.1 1,16 72,47 2,106 1,28 69.50 1.741 1 20.2 1.02 70.64 2,609 1.24 63.45 2.332 AT. 19 1,06 72,65 2.132 1.20 62.24 1.784 Ị
Theo kết quả phàn tích của Trung tâm kiểm tra và tiêu chuấn hoá chất lượng nông sản thuộc Viện sau thu hoạch, chất lượng rau ờ các công thức bón 86.2, 76.1. 20.2 đều rất tốt. Đặc biệt hàm lượng nitrat ờ các công thức bón chủng 86.2 và 76.1 thấp hơn rau đối chứng.
4. KẾT L U Ậ N
1. Việc hong khỏ đ í t làm tăng tính chọn lọc khi phân lập A-.otebaaer. Loa, vi khuân nay chi được phat hiện ơ các mâu đất có pH từ 5 15 đến 7 75
2. Ba chủng A zotobacter kí hiệu 86.2, 76.1, 20.2 sinh trưởng tốt trẽn môi trường nhân tạo và có hoạt tính A R A cao hơn so với chủng đối chứng là ,4. chroococcum
AT 19 tư 17,0 — 56,78 nM C2H 4/ml/h. Sinh tông hợp IAA của ba chủng này cao hơn chủng nhập nội A .chroococcum AT. 19 từ 0,44 đến 2,37 us/ml.
3. Chủng 86.2 có khả năng phàn giải chất diệt cò 2.4D. Hoạt tính tuy chưa cao nhưng là một điểm rất đáng được chú ý.
4. Cả 3 chủng thí nghiệm đều kích thích sự nảv mầm cùa hat neô lai ĐK.888 và nsò tẻ p .ll cũng như làm tăng nãng suất và cải thiộn chất lượnơ rau cải trắng.
5. Có thể sử dụng cả 3 chủng này để sản xuất phàn bón vi sinh vật sau khi đươc đánh giá hoạt tính trên qui mô lớn hơn.
5. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Vũ Hài, Trần Qúi Hiển (2001), Nghê làm vườn, tái bản lần thứ nhất. Nxb Giáo dục, tr. 82 - 85.
2. Trần Quang Hùng (1991), Thuốc trừ dịch hại bào vệ cây trỏng. Cue trổng trọt và bảo vệ thưc vật, Bộ Nông nghiệp và CNTP . tr. 128 - 142.
3. Vũ Vãn Vụ, Hoàng Đức Cự. Vũ Thanh Tâm. Trần Văn Lài (1997), Sinh lý
học thực vật, Nxb Nông nghiệp. Hà Nội.
Tiếng Anh
4. Cox c (1999), "2.4D: Toxicology", J. pesticide reform / spring, 19. pp. 1 4 - 19.
5. Diab A., Gounain M. Y. (1984). "Distribution of Azotobacter, Actinom ycetes. Cellulose - degrading. Acid - producing and Phosphate - dissolvinơ bacteria in desert and salt m arch soil ot Kuwaite , Zbl. M ikrobiol,
139, pp. 425 - 4 3 3 .
6 Essawy El. A. A.. Saved El. M.. Mohamed Y. A. H.. Shanshoury El. A. (1984) “Effect of combined nitrogen in the production of plant growth regulation by Azotobacter chroococcum ". Zbl. M ikrobiolo, 139. pp. 327 -
333.
7 Gonzles Lopez J-. Salmerson V.. Monero J-. Cormenaza - Kamoz A. (1983), Amino acids and vitamins produced by A zow bacter vinelandii ATCC 12837 in chemically - defined media and d.alycsed soil media” . Soil Biol. Biochem..
15, pp. 711 - 7 1 3 .
8. Ish.zawa s.. Suzuk, T.. Ararag, A. (1975,. -Effect of soil on Nitrogen fixation ' by A zo w b a cter v in e lm d ir . nitrogen fixation and Nitrogen cycle. 12. pp. 61
- 6 7 .
9. Klaasen c . D., Watkins III J. B. (1999). Casarett and D oull's toxicology - the
basic science of poision, 5th. Me Graw - Hill. pp. 561 - 564.
10. Latus M., Seitz H. J., Eberspacher J. V., Lingen R. (1995), "Purification and Characterization of Hvdroxvquinol 1,2 - dioxvgenase from Azotobacter sp. Strain GP 1", Appl, Environ. M icrobiol., 61. pp. 2453 - 2460.
11. Lee M., Breckenndge c ., Knowles R. (1970). “Effect of some culture conditions on the production of indol - 3 - acetic acid and gibberellin - like - substance by Azotobacter vinelandii" . Can. J. M icrobiol., 16. pp. 1325 -
1330.
12. Li D. Y.. Eberspacher J., W aaner B., Kuntzer J., Lingens F. (1991), ” Degradation of 2,4.6 - trichlorophenol bv Azotobacter sp. Strain GP 1", Appl, Environ. Microbiol., 57, pp. 1920 - 1928.
13. Mishustin E. N.. Shilnikova V. K. (1969), '‘Free - living nitrogen - fixing bacteria of the genus Azotobacter" , Soil Biology, UNESCO, pp.72 - 124. 14. Misra s.. Kaushink B. D. (1989), Growth prom oting subtances o f
Cyanobacteria. //. Detections o f amino acids, sugars and auxins. Proc. Indian nant. Sci. Acad, 55. pp. 499 - 504.
15. Rudnick p.. Meletzus D.. Green A., He L., Kennedy c . (1997), "Regulation
o f nitrogen fixation by a m m o n iu m in diazotrophic s p e c ie s o f proteob actena" .
Soil biol. Biochem., 29. pp. 831-841.
16. Sharma p. K.. Chahal V. p. s. (1985). "The effect of amino group acceptors on the production of indolyl acetic acid from tryptophan by A zotobacter”,
M icrobiol., 55. pp. 1041 - 1043.
17. Subba Rao N. s. (1980), ”Azotobacter inoculant”, Bioffertilizers in Agricultures, 2th. Oxford and TBH publishing Co.. pp. 77-79.
18 Tchan Y. T.. Peter D. (1984), "Genus Azotobacter", B ergey's manual o f system atic Bacteriology. Williams Wilkins - Baltimore - London, pp. 221 - 231.
đ ạ i h ọ c q u ố c g i a h à n ộ i
TRUỒNG ĐẠI 1IỌC KUOA HỌC T ự N H I Ê N KHOA SINH HỌC
/
I lo à n g T h ị L an A n il
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CIIỌN CÁC CHỦNG
AZOTOBACTER CỎ ĐẶC TÍNH SINH HỌC QUÍ
K H O Á LUẬN TỐT NGHIỆP HỆ ĐẠI HỌC C H ÍN H Q U Y
N gàn h : C õng n g h ệ sin h hục
C á n bộ hư ớ n g d ần : T S . N g ò T ự T h à n h
t ạ p ch í
DI TRUIỀN h ọ c & ÚNG d ụ n g
g e n e t i c s a n d a p p l i c a t i o n s
1AA V..A - n . . . I,SSN : 0 8 6 6 -8 5 6 6
u ân T h u ỷ , H à N ộ i. Tel: 7 5 4 0 6 0 2 , 7 6 8 0 7 4 7 ; Fax: 7 5 4 0 6 0 2 E -m a il : L u o n g @ h n .v n n .v n
G Ỉ Á Y B I Ê N N H Ậ N
Nhận của ổng A / Ổ ổ _ T i p - T H A N H
Cơ quan : /O W _ n-aỉỷhc fcfua tfữc /õ//y/
SỐ tiển : ' '
v c . c c o *
Bằng chữ : ự V o Y / u * v , m u 'o ^ é /ỉỹ : )
v ể khoản : L ệ 6*0 Ợ c P Ĩ T & r ì r i rfirc* i/*Ể.
ả>a ' : tr9 ~&c ~ fv ré j ù / < ~fĩsc-c C C iữ r r i o / ~ 'Ịrò' c J lu s y , r f jz a ý o Ẩ > ổ ĩc fe S"
Hà Nội, ngàyV é tháng ^ Jn ăm 200l5
đ ạ c t i n h s i n h h o c c ủ a m ộ t s ố c h ủ n g AZOTOBACTER
NGÔ T ự T H À N H , v ũ THỊ MINH ĐÚC . Trường Đ ại hoc Khoa học Tự nhiên Hà N ội
n g u y ễ n t h ư Hà, n g u y ễ n n g ọ c q u y ê n
Viện Khoa học K ĩ thuật Nông nghiệp Việt Nam
nhân từ lâu S ờ đ ! nhn \ ^at băng kuyền dictl A zotobacter trước khi gieo ưổng dã đươc ghi
axit amin c ũ n e như các chất k-A 'h' z ° ỉ o b a c t e r c ° khà nâng cở' định nitơ, tiết vào mỏi trường các vitam in,
Gần đâv mò ^ “ 5 trường thư‘ * i « * E axetic. gibberel.c) [5. 8].
4 tnhnrtpr cn r n i rn Vh ’ ^la ù 2 ^ ân ^ c^ẻ và mÒ rá m(^ sỏ tin^ c“a enz>m từ
í Ĩ\M Iinơ rhir h • * naf~~ ^ ,ản_® ^ ~ trichlorophenol (một hợp chất đôc, gày kích thích, tác
an 1 rt rhiino'yi / A em ! mỏ‘ tru^ns sống). Nghiên cứu này nhầm vào các dãc tinh sinh hoc cùa một sỏ chủng A zo to b a cter mới phàn lập, có so sánh vơi A. chroococcum A T19 nhập nội.
I. VẬT L IỆ U V À P H Ư Ơ N G PH ÁP
Vi sinh vặt: A zo to b a c ter chroococcum AT19 nhàp nổi đươc sừ dung làm chùng đối chứng. Các chùne
Azotobacter đươc phàn lâp từ đất cùa các vùng chuyên canh rau màu. trên mỏi trương Burk. Việc phaii lap
được tiến hành VỚI hai lõ đất: lô đươc giữ nguyên độ ám ban đáu và lỏ được hong khỏ ờ nhièt độ phòng rổi
nghiên mịn.
Xác định khả n â n g cò định nitơ
Kha năng này được xác định bàng cách đo hoat tính nitrogenza theo phương pháp khử axetvlen trẽn máy săc ký khí PYE UNICAM series 204 chromatograp (Anh).
Xác định ax it in d ol-3 - axetic (IAA)
Tien hanh theo chi dản cua [7], Chung được cấy vào bình nón chứa 50 ml mòi trường Burk có chứa tryptophan 0,1% , nuỏi trên máy lắc 200 vòng/phút ờ 30"c trong 5 ngày. Li tám loai bo tế bào. Làv 2 ml dịch trong thèm vào ổng nghiém chứa sẩn 8ml thuỏc thừ Salkowski cài tiến, lác dểu. Đế ớ nhiệt "dộ phòng 30 phút. So mầu ờ bước sóng 530 nm. Hàm lương IAA đươc tính toán dưa theo đổ thị chuàn.
Xác định khả n ân g phàn giải 2,4 dichlorophenoxyacetate (2.4D)
Trước khi cấy vi khuẩn. 200 mg 2,4D đươc thèm vào 1 lít mỏi trường vổ trùng có hàm lương glucoza ờ các mức 0, 5, 10, 15, 20 g/Iít. Nuôi lắc 200 vòng/phút trons 5 ngày. Li tầm lanh 6500 vòng/phiĩt trong 15 phút. Dịch trong được lọc qua phiến lọc khuấn 0,2 LL m vò trùng để loại hết tế bào còn sót lai. Đo phổ hấp phụ trẽn thiết bị tử ngoai - khá biến - hổng ngoai gán ( u v - VIS - NIR - Scanninơ spectrophotometer ƯV 3101 PC) (Shimadzu - Jp). Đối chưng là dịch nuôi VI khuấn nhuna khônơ bổ sung 2.4D và dịch m õi trường có bố sung 2,4D nhưng khỏng cấy vi khuẩn. Hàm lươna 2.4D đươc tính theo đỗ thị chuẩn đã xác định trên máv ờ bước sóng 283 nm [1].
Xác định ản h hường cùa dịch nuỏi A zotobacter spp. tới sư này mám ờ hat ngò
Hat g iốn g ngô tẻ p . l l và ngõ lai ĐK.888 đươc khử trùng băng H g G : 0.1% tron? 4 phút. Rửa lại bằn2 nước cất vô trùng nhiều lần. Nsàm hạt trong nước càt vô trùng từ 3 đến 4 giờ. Sau đó ù hạt với dich vi sinh vật đã li tàm loại bỏ tế bào ( pha loãng tý lệ 5%) ơ 30ưc trong 2 ngày.
Thí nghiêm ở q uv m ò ch ậu vai với rau cài tráng
Thi nghiệm được tiến hành trong 2 vụ đông xuàn và hè thu. Mỗi châu chứa 7kg đất. Nén phàn bón 40 N: 80 p:0 4: 40 K2Ò. Còng thức thí nghiệm đươc bón thèm 10' tế bào A zotobacter /chầu. Thi nghiêm được lặp" lại 3 lần. Sau 45 ngày trổng, thu hoach và đánh giá theo các chi tiẽu: số lá/cháu, khỏi lươn° tươi thân lá chiều cao cày, % vặt chất khỏ. Hàm lương vitamin c , đường tổng số và hàm lươna N 0 3 được xac định tại Trũng tâm kiếm tra và tièu chuán hoá chất lương nòng sàn thuộc Viện sau thu hoạch.
II. KẾT Q U Ả VÀ T H A O LUẬN
1- Phàn làp A z o to b a c te r spp. từ các máu đát
Từ 13/38 mẫu đất honơ khò và 6/12 mảu đất giữ nguyên dô ám đã phát hiện sư có mãt cúa .4zotobacter. T uv nhien các chung thu nhận từ đất khó tổn tai tốt trong điểu kiên nuôi cày nhàn tao. Các
chủng phàn lập từ đất ẩm dể bị chết sau mỏt rhòi mo 1 ’ .
với A zom onas (loại vi khuẩn c ố đinh n o h nh ỉ } ,quản tr0ng ống n?hiẹm và dể bị abẳm lản
spsvz IX. & * mỉsĩSìSSSữ S ầ S ầ
không ở c ĩ mâu c ó 'pH M p t m T h r om u Z ' Z lhuờ"s c ° mát 4 các m ểa - ° dô pH 5 - 15 : 7 '75 ' chứ
dất CO pH a x it yếu đ ến kiềm. trươc đây [9] thì A zotobacter thường tồn ta. trong
1 (acetylene reduction assay - A RA)
-■ h ’ ^hirnc Cp U4° ^ c*ư^c ’ chúng tỏi đã phát hiện 3 chùng có hoat tính ARA cao hơn so