3. Kết quả và thảo luận
3.5 Sự phân giải 2, 4D
2.4D là mơt trong chất trừ cỏ dại cĩ cơ chế tác duns theo kiểu bắt chước hoạt đơng của auxin như IAA. Lơi dụng đặc tính kích thích sinh tr ư ớ n ơ thưc vât.nhiều người trồng rau ở nước t a đã phun 2,4D VỚI liểu lương thấp khiến rau trở nên xanh non giả tạo đánh lừa nsười tiêu dùng. Tuy nhiên, cũng như các chất chlorophenoxy khác 2,4D là chất đơc đối với con người. Nhiều vu ngộ đơc rau do phun 2.4D đã xày ra ờ nước ta. Thêm vào đĩ. thời gian tư phân hưỷ cua 2.4D kéo dài tới 3 thang [9]. Như vây c ũ n ơ cĩ nơhĩâ là dư lượng chất diệt co nàv tịn tai trong rau và đât cunh tác là vấn để rất đáns lo nơại. Tuy chưa sưu tầm được tài liệu vé kha năng phàn giải 2 4D của Azotobacter nhưng chúng tơi đâ nhản được nhữnẹ bai bao viết vè khá nănơ phân ơiải TCP của loai vi khuàn này. Xuat phíìt tư cơ sơ đo chung toi đd đíìt thí nghiệm tìm hiểu khả năng phàn giải 2.4D cua các chung Azotobucter phàn làp được. Chủng 86.2 cĩ mơt số đãc tính giống như ơ A.chroococcum và cĩ kha năng sinh trường trên mịi trường V Ớ I benzoat-Na là nguỏn cacbon duy nhất đươc sư dung trong thí nghiêm này.
Hình 6. Lựa chọn các chùng cĩ khả nãng sinh trưởng trên MT B cĩ bổ sung 200 m2 2.4D/1ÍÍ
Về khả n ăn s phân giải 2.4D thươns phấm của chùng 86.2 chúng tơi nhân thấy VỚI hàm lượng 200mg/ĩít 2,4D là nơuổn cacbon duy nhất các chung đêu sinh trươnơ kém. Vièc bổ sun? 5, 10. 15. 20ơ/lít glucoza tao điểu kièn tốt cho tế bào phát triển và lượnơ 2.4D cịn sĩt lai tươns ứng V Ớ I lương glucoza bỏ sung nĩi trên là 179.5; 127 T 145 8' 156.9 mg/lít. Phổ hấp phu cua 2.4D trong các mảu nuơi cấỵ quét trẽn thiết bị tử n ơoại - khả biên - hịns nsofli £àn được tnnh bâỵ ơ CQ C hình I'd. 7b, /C. 7d.
Hình 7b. Đơ hấp phu của 2.4D trong mẩu nuơi cấy cĩ bổ sung glucoza 5g/l (hàm lương 2,4D cịn lai là 179.5mg/l)
Hình 7c Độ hấp phu của 2,4D trong mẫu nuơi cấy cĩ bơ sung glucoza 10g/l (hàm lượng 2,4D cịn lại là 127,7mg/l)
Hình là . Độ hấp phu cua 2,4D trong mẫu nưỏi cấy cĩ bơ sưng glucoza 20g/l (hàm lương 2,4D con l'à\ líi lo6.9mg/])
Qua các kết quả trẽn chúng tơi nhân thấy chùng 86.2 cĩ khả nãng phân giải 2.4D. Khi 10 g/1 glucoza được thêm vào mơi trường, lương 2.4D cịn sĩt lai là thấp nhất. Tuy hoạt tính khơng mạnh như ở các chi Pseudomonas, Alcaligenes... nhưng đây là một đạc tính quý của chủng Azotobacier mà chúng tơi phân lâp đươc.
Đè chứng minh sự cĩ mặt của các chất kích thích sinh trường thưc vật cĩ trong dich nuơi Azotobacter, chúng tơi đã tiến hành các thừ nghiệm sinh hoc (biotest) tại Viện Khoa học kỹ thuật Nơng nghièp Vièt Nam. Kết quà đươc trình bày ở các mục dưới đây:
3.6. Ảnh hưởng của dịch nuơi đến sự nẩy mầm của hạt n?ị
Sau khi xư lý và ngầm ủ với dịch nuơi câv pha loans 5%, chúng tơi nhận tháv dịch nuơi các chúng 86.2, 76.1, 20.2 đều kích thích sự nảy mầm cua hat ngõ (bảnơ 7
và hình 8). Với ngơ lai ĐK.888 tỷ lệ nảy mầm tăng từ 8,57 đến 14,29% so VỚI đối chứng khơng ngâm ủ với dịch vi khuẩn. Tỷ lệ này mầm ờ ngơ tẻ p . l l tâng 5.71%. Đặc biệt ở chủng 86.2 làm tãng sự nảy mầm của hạt ngị lai ĐK.888 lẽn 2.86% so với chủng AT. 19.
Bảng 7. Ảnh hưởng của dich nuịi Azotobacter spp. đèn sự nảy m ầm cùa hat ngị.
Chủng Tỷ lệ náv mầm (%) Nsỏ lai ĐK.888 Nsị te P. 11 Đối chứng (H20 ) 48.57 94.29 86.2 62,86 100 76.1 57,14 100 20.2 60.00 100 AT. 19 60.00 100 25
86.2 Đối chứng AT. 19
Hình 8. Anh hương cứa Aiotobcicter lên sự nảy mầm cúa hat ngị lai ĐK. 888
3.7. Năng suất và chất lượng rau cải tráng khi đươc bĩn thèm Azotobacter sp.
Thi nghiệm được tiến hành ớ qui mơ châu vại tai Viên khoa hoc kĩ thuàt nịn° nghiệp Việt Nam. Ngồi nền phàn NPK, mỏi chậu đươc bĩn thèm 10’ CFU
Azotobacter sp. Sau 45 ngày, nãng suất cũng như chất lương rau cái trâng dươc kiếm tra. Kết quả được nêu trong bảng 8. 9 và hình 9.
Bảng 8. Năng suất rau cải tráng khi được bĩn thèm Azotobacter sp.
rI
Vụ đơng xuân Vu hè thu
Sỏ' : Khối lương 1 Tích Số Cao Khối lương Tích Iuv Chúngo
lá/chậu tươi thân lá (g/chậu) Iuỹ chất khơ (%) lá/chàu cây (cm) tươi thân lá (2/chậu) chát khị (%) Đối chứng 49,0 90.2 5.86 33.3 r 1 r i 108.3 5.81 86.2 53,7 121.9 6.63 34.7 23.3 126.7 6.33 76.1 49,0 141.5 6,33 35.3 22.4 110.0 6.25 20.2 1 49.7 110.0 5.98 33,0 22.6 120.0 6.02 AT. 19 50.3 121.9 6.32 33.7 23.6 108.7 6.55
ở cả hai vụ đơng xuân và hè thư, cơng thức bĩn chùng 86.2. 76.1 '’0.'’ đều cho nãng suất cao hơn cõng thức đối chứng (khỏng bĩn A z o to b a a e r ) v~à tương đương với cơng thức bĩn chúng AT. 19 (chủng đố! chứng). Chất lương rau cải trắng được bĩn thêm A zotobacter sp. được trình bày ở bản° 9.
Bảng 9. Chát lượng rau cài tráng được bĩn thèm Azotobacter sp.
Chủng
Vụ đơng xuân Vu hè thu
■ 1 1 Đường tổng số(%) Vitamin c (mg/100g) N 0 3- (mg/kg) Đường tổng số (%) Vitamin c (mg/lOOs) NO,- i (ms/ks) ^ 1 Đối chứng 0,92 70,37 2,745 0,96 62.91 2.270 Ị 86.2 1,04 78,17 2,095 1,36 64,52 1.908 76.1 1,16 72.47 2,106 1.28 69.50 1.741 20.2 1.02 70.64 2,609 1.24 63.45 2.332 AT. 19 1,06 72,65 2,132 1.20 62.24 1.784
Theo kết quả phân tích của Trung tâm kiểm tra và tiêu chuấn hố chất lương nỏnơ sản thuộc Viên sau thu hoạch, chất lượng rau ơ các cịng thưc bon 86.2. 76.1. 20.2 đều rất tốt. Đặc biêt hàm lượng nitrat ờ các cồng thức bĩn chùng 86.: và 76.1 thấp hơn rau đối chứng.
4. KẾT LUẬN
, Viéc hong khị đ í t lạm tăng tính chon loc khi phán lap A:o,oba a e r Loa, V, khuẩn này chỉ được phát hiên ở các mẫu đất cĩ pH từ 5 15 đến 7 75
2 Ba chùng A zotobac.er kí h.ệu 86.2, 76.1, 20.2 sinh .rtịng ,6t trén mơi .ruịng nhàn tạo và cĩ hoạt tính AR A cao t a so vĩ, chúng đối chứng là ,4. chroococcum
a t 19 từ 17,0 - 56,78 nM C, H4/mI/h. Sinh tổng hợp ỈAA cùa ba chúng này cao hon chủng nhập nội A.chroococcum AT. 19 từ 0,44 đến 2.37 ug/ml.
3. Chủng 86.2 cĩ khả năng phàn giải chất diệt cỏ 2.4D. Hoai tính tuy chưa cao nhưng là một điểm rất đáng được chú ý.
4. Cả 3 chủng thí nghiêm đểu kích thích sự nảy mầm cua hạt ngơ lai ĐK.888 và nợỏ tẻ p.ll cũng như làm tãng nãng suất và cải thiện chất lương rau cài tráng.
5. Cĩ thể sử dung cả 3 chúng này để sản xuất phàn bĩn vi sinh vàt sau khi đươc đánh giá hoạt tính trên qui mơ lớn hơn.
5. TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Vu Hai, Trân QÚI Hiên (2001), Nghê làm vườn, tái bản lần thứ nhất. Nxb Giáo dục, tr. 82 - 85.
2. Trần Quang Hùng (1991), Thuốc trừ dịch hai bào vệ cày [rồng. Cue trổng trọt và bảo vệ thưc vật, Bộ Nơng nghiêp và CNTP . tr. 128 - 142.
3. Vũ Văn Vụ, Hồng Đức Cư, Vũ Thanh Tàm. Trần Vãn Lài (1997), Sinh ly học thực vật, Nxb Nơng nghiẻp, Hà Nơi.
Tiếng Anh
4. Cox c. (1999), "2.4D: Toxicology”. J. pesticide reform / spriniỊ, 19. pp. 1 4 - 19.
5. Diab A.. Gounain M. Y. (1984). "Distribution of Azotobacter, Actinomvcetes. Cellulose - degrading. Acid - p r o d u c i n g and Phosphate - dissolvinơ bacteria in desert and salt march soil of Kuwaite” . Zbl. Mikrobiol,
139, pp. 425 -4 3 3 .
6 Essavvy El. A. A.. Saved El. M.. Mohamed Y. A. H.. Shanshourv El. A. (1984) “Effect of combined nitrogen in the production of plant growth regulation bv Azotobacter chroococcum". Zbl. Mikrobiolo. 139. pp. 327 -
333.
7 Gonzles Lopez J.. Salmerson V.. Monero J.. Cormenaza - Kamoz A. (1983), “ Amino acids and vitamins produced by A zoto ba a er vinelandii ATCC 12837
in c h e m i c a l l y - d e f i n e d m e d i a a n d d i a l v c s e d so il m e d i a " . Soil Biol. Biochem..
15, pp. 711 - 713.
8. Ishizawa s.. Suzuki T.. Ararag. A. (1975). "Effect of soil on Nitrogen fixation
bv A - o t o b a c t e r v in e la m lu " . N itro g e n fi x a t i o n a n d S i t r o o e n c y c le . 12. pp. 61
- 6 7 .
9. Klaasen c. D., Watkins III J. B. (1999). Casarett and Doull's toxicology - the basic science o f p01,Sion. 5Ih. Me Graw - Hill. pp. 561 - 564.
10. Latus M., Seitz H. J., Eberspacher J. V., Lingen R. (1995), "Purification and Characterization of Hvdroxvquinol 1.2 - dioxvgenase from Azotobacter sp. Strain GP 1 , Appl, Environ. Microbiol., 61. pp. 2453 - 2460.
11. Lee M., Breckenndge c.. Knowles R. (1970), ‘‘Effect of some culture conditions on the production of indol - 3 - acetic acid and sibberellin - like - substance by Azotobacter vinelandii". Can. J. M i c r o b i o l16. pp. 1325 -
1330.
12. Li D. Y.. Eberspacher J.. Wagner B.. Kuntzer J.. Linsens F. (1991). " Degradation of 2,4,6 - trichlorophenol bv Azotobacter sp. Strain GP 1". Appl. Environ. Microbiol., 57, pp. 1920 - 1928.
13. Mishustin E. N., Shilnikova V. K. (1969). “Free - living nitrogen - fixing bacteria of the senus Azotobacter". Soil Biology, UNESCO, pp.72 - 124. 14. Misra s.. Kaushink B. D. (1989). Growth promoting subtances o f
Cyanobacteria. II. Detections o f amino acids, sugars and auxins. Proc. Indian nant. Sci. Acad. 55. pp. -4-99 - 504.
15. Rudnick p.. Meletzus D.. Green A.. He Kennedy c. (1997), "Regulation of nitrogen fixation by ammonium in diazotrophic species of proteobactena".
Soil biol. Biochem., 29. pp. 831-841.
16. Sharma p. K.. Chahal V. p. s. ( 1985). ''The effect of amino group acceptors on the production of indolyl acetic acid from tryptophan by Azotobaaer", Microbiol.. 55. pp. 1041 - 1043.
17 Subba Rao N. s. (1980). “Azotobacier inoculant", Bioffertihzers in Agricultures. 2,h. Oxford and TBH publishing Co.. pp. 77-79.
18 Tchan Y T Peter D. (1984). "Genus A z o t o b a c t e r B e r o e y 's manual o f systematic Bacteriology. Williams Wilkins - Baltimore - London, pp. 221 -
231.
đ ạ i h ọ c q u ố c g i a h à n ộ i
TRUỒNG ĐẠI 1IỌC KHOA HỌC T ự N H I Ê N KHOA SINH HỌC
Ilơ à n g T h ị L an A nil
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG
AZOTOBACTER CĨ ĐẶC TÍNH SINH HỌC QUÍ
KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP HỆ ĐẠI HỌC CHÍNH QUY
Ngành: Cõng ngliệ sinh học
C á n bộ hư ớ n g d ầ n : T S . N g ơ T ự T h à n h
v t ạ p c h í
DI TRUYỀN HỌC & ÚNG DỰNG
g e n e t i c s a n d a p p l i c a t i o n s
ISSN : 0866-8566
144 Xuân Thuỷ, Hà Nội. Tel: 7540602, 7680747; Fax: 7540602 E-mail : Luong@hn.vnn.vn
GIẤY BIÊN N H Ậ N
Nhận của ơng fail) /V ổ Ố _ T-HAN H „
C ơ quan : /T /W /7^ _ 7t e -f a r '/D W T^c
SỐ tiền : ' ' r-
\ 0 . 0 ơ < 3
Bằllg chữ : ( A / o f m u'*: A ỹã., đ G ỹ ef***- )
v ề khoản : L ệ f & 'étèý &T' r/-c r ĩ /■**•r f* rtc *
&>&■' r ' / ỉ ì c ~f/r4ý ỉ?/^C c c ĩữ r > í c / c / l u y . r t s t a ’/oẨ > dTcfef~ JỊ
Hà Nội, ngày^ ế tháng CỔ năm 200l§
đ ạ c t i n h s i n h h o c c ủ a m ộ t s ố c h ù n g A Z O T O B A C T E R
NGỎ T ự T H À N H , v ũ THỊ M IN H ĐỦC _ Trường Đại hoc Khoa hoe T ư nhiên Hà N ội
N G U Y Ễ N THƯ HÀ, N G U Y Ễ N N G Ọ C Q U Y Ê N Wện Khoa học K ĩ thuật N ơng nghiẻp Việt N am
' C^ a V1^C xư ^ ^ at kàn § huyển A zotobacter trước khi gieo ưổng dã đươc gh1
nhận tư lảu [ ]. uơ ui ư vậy la do Azoỉobacter cĩ khả nâng cố dịnh rntơ, tiết vào mỏi ưường các vitamin, áxỉt amin c ũ n g n h ư các chất kích thích sinh trường thưc vật (axit mdol axetic, gibberelic) [5 8],
o a n y m sơ tạc gia [4, 6] đã phàn lâp, tinh c h ế và mỏ rả mỏt số dâc tính cùa enzim cừ
Azotobacter sp. GD1.CĨ khả năng phán giải 2,4, 6 - tnchlorophenol (một hơp chất đỏc, gày kích thích, tác
nhân gày ung ^ ư, nguy hiem đỏi VỚI mỏi trường sống). N ghièn cứu này nhầm vào các dầc tính sinh học
cua một số chung A zo to b a cter mới phàn Iâp, cĩ so sánh VĨI A. chroococcum A T I 9 nhập nội. L VẬT L I Ê U V À P H Ư Ơ N G P H Á P
Vi sinh v ậ t: A zo to b a c te r chroococcum A T I9 nhàp nội đươc sừ dung làm chùng đối chứng. Các chùng
A iotobacter được phân lặp từ đất cua các vùng chuyên canh rau màu. trẽn mỏi trường Burk. Việc phán lâp dược tiến hành vơi hai lơ đất: lơ đươc giữ nguyên độ ấm ban đẩu và lỏ đươc hong khỏ ờ nhiét đơ phịng rịi nghiển mịn.
Xác đinh k h ả n â n g cỏ đ in h nitơ
Khả nâng này đươc xác đinh bằng cách đo hoat tính nitrogenza theo phương pháp khử axetvlen, trên máy sác ký khí P Y E U N IC A M series 204 chromatograp (Anh).
Xác đinh axit indol-3- axetic (IAA)
T iến hành theo chí dẫn của [7]. Chùng dươc cấy vào bình nĩn chứa 50 ml mịi trường Burk cĩ chứa tryptophan 0,1% , nuơi trên máy lắc 200 vịng/phút ơ 30°c trong 5 ngày. Li tầm loai bo tế bào. Láy 2 ml dich trong thèm vào ĩng nghiêm chứa sẩn 8ml thuốc thử Salkowstd cải tiến, lác đều. Đé ờ nhièt đỏ phịng 30 phút. So mầu ở bước sĩng 530 nm. Hàm Iưcmg IAA đươc tính tốn dưa theo dồ thị chuàn.
Xác định k h á n á n g p h à n giải 2,4 d ich lo ro p h e n o x v a c e ta te (2,4D)
Trước khi cấy vi khuấn, 200 mg 2,4D đươc thèm vào 1 lít mổi trường vỏ trùng cĩ hàm lương glucoza ớ các mức 0, 5, 10, 15, 20 2/1ít. Nuịi Iãc 200 vịng/phuĩ trong 5 nơày. Li tàm lanh 6500 vịng/phút trong 15 phút. Dịch trong được lọc qua phiến loc khuân 0,2 U m vị trùnơ dê loai hết tẻ bào cịn sĩt lai. Đo phổ hấp phụ trèn thiết bị từ ngoai - Ịcha biến - hổng ngoai gán ( u v - VIS - NIR - Scanning spectrophotometer ư v 3101 PC) (Shimadzu - Jp). Đỏi chứng là dịch nuơi VI khuãn nhưng khỏng bị sung 2.4D và dịch mồi trườnơ cĩ bổ sung 2,4D nhưng Ịchỏng cáy vi lchuàn. Hàm lương 2,4D đươc tính theo đổ thị chuấn đã xác định trên máy ờ bước sĩng 283 nm [1J.
Xác định ả n h h ư ở n g c ù a dịch nuịi A zotobacter spp. tới sư nay m â m ơ hat ngị
Hat giốnơ ngổ tẻ p . l l và ngỏ lai Đ K .888 đươc khư trùng bảng HgCl2 0, 1^0 trong 4 phút. Rừa lai bans nước cat vỏ trùng nhiểu lần. Ngầm hạt trong nươc cất vỏ trùng tư 3 dến 4 giờ. Sau dĩ u hạc VỚI dich vi sinh vật đã li tâm loại bị tẽ bào (pha lỗng ty lẻ 5%) ơ ^0 c trong 2 ngay.
Thí nghièm ờ q u v m ị c h à u vai với ra u cải trâ n g
Thí nghiêm được tiến hành trong 2 vụ đơng xuân và hè thu. Mỗi châu chứa 7kg đất. Nén phàn bĩn 40 N* 80 p 0 . - 40 K i ổ C ị n 2 thức thí nghiêm đươc bĩn thèm 10 tế bào A zotobacter /châu. Thí nghiệm đươc lap lai 3 lán Sau 45 ngày trổng, thu hoach v à d á n h giá theo các chi tièu: số lá/châu, khĩi lương tươi thân lá chiều cao cày, % vàt chảt khị. Hàm lương vitamin c đường tổng sơ và hàm lưcmg N ỏ 3 dược xac đinh tại Trung tam kiếm tra và tiêu chuan hố chát lương nỏng sản thuộc Viên sau thu hoạch.
II. KẾT QUÀ VẢ THAO LUẬN
1* Phàn làp A z o to b a c te r spp. từ cac m àu dàt
Từ 13/38 m au dal hong khĩ và 6/ l í mảu đâl j i ữ nguyên đơ i m dã phá. h,ẽ„ , ư cĩ M I cua
dian dàl*bà° quản trcng Ĩn§ nghlẻm và dẻh' Í T h ™
\ r u ràn a r,nh I A L s s ^ n g A zoiobacter nhưng khỏng hình thành bào nan® ỌC, VI c hong khỏ đất ờ nhiẻt đỏ phịng trước khi phần làp A zoto b a cier là cẩn thiết.
V iệc phản ,tiCỊ\ cho thày Azotobacter thường cĩ mát ờ các mảu cĩ đơ pH 5.15 - 7,75. chứ lchỏng ơ cac m u co J> t p ơn. Theo một nghiên cứu trước dâv [9] thì A zotobacier thường tổn tai trong đát cĩ pH axit yếu đến kiềm.
2. Phản ứng k h ử ax ety len - etylen (acetylene reduction assay - ARA)
sơ các chung phàn lập dược, chúng tơi đã phát hiẻn 3 chùng cĩ hoat tính A R A cao hơn so