E.coli
Dòng plasmid số 1 sau khi khẳng định bằng phƣơng pháp giải trình tự gen đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến BL21 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt và đƣợc nuôi cấy chọn lọc trên môi trƣờng LB agar có bổ sung Ampicilin 1000 µg/mL ở 37oC qua đêm. Trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc màu trắng chứng tỏ các khuẩn lạc này đều mang vector tái tổ hợp. Tiếp theo, cấy hoạt hóa 1 khuẩn lạc vào môi trƣờng LB bổ sung Ampicilin 1000 µg/mL qua đêm. Cấy chuyển 1% thể tích dịch môi trƣờng nuôi cấy qua đêm sang môi trƣờng LB mới bổ sung Ampicilin µg/mL theo thể tích phù hợp, nuôi lắc tế bào ở 37oC cho đến khi OD của môi trƣờng đạt 0.6-0.8 thì bổ sung IPTG để cảm ứng biểu hiện protein đích. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát 2 nồng độ IPTG là 0.5 mM và 1 mM, thời gian biểu hiện là 3h và 16h, nhiệt độ biểu hiện ở 25oC, 30oC và 37oC. Protein tổng số của các thí nghiệm đã khảo sát đƣợc điện di đồng thời trên cùng 1 bản gel SDS-PAGE 12% (Hình 3.7).
Hình 3.7. Kiểm tra sự biểu hiện của kháng thể kháng CD47 ở tế bào vi khuẩn E.coli
BL21DE3 bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE. M. marker protein, 1. Mẫu trƣớc cảm ứng, 2. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5 mM, thu mẫu sau 3h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 37oC, 3. Mẫu cảm ứng IPTG 1 mM thu mẫu sau 3h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 37oC, 4. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5
29
mM, thu mẫu sau 5h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 37oC, 5. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5 mM, thu mẫu sau 16h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 37 o
C, 6. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5 mM, thu mẫu sau 16h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 25oC, 7. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5 mM, thu mẫu sau 16h cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy 30oC, 8. Mẫu cảm ứng IPTG 0,5 mM, thu mẫu sau 16h cảm ứng,
nhiệt độ nuôi cấy 37o C.
Kết quả điện di trên Hình 3.7 cho thấy khi có mặt chất cảm ứng IPTG ở tất cả các mẫu đã khảo sát tƣơng ứng với các đƣờng chạy từ 2-8 đều xuất hiện một băng đậm có kích thƣớc khoảng 39 kDa đƣợc dự đoán là kích thƣớc của kháng thể anti-CD47. Trong khi đó, mẫu không đƣợc cảm ứng IPTG (đƣờng chạy số 1) không có băng này. Ở nồng độ chất cảm ứng 0.5 mM, thời gian cảm ứng 3 h, nhiệt độ nuôi cấy là 37oC, protein đích đƣợc biểu hiện mạnh nhất thể hiện qua băng đậm (đƣờng chạy số 2). Tại nồng độ IPTG 0.5 mM, thời gian cảm ứng 16 h và nhiệt độ nuôi cấy lần lƣợt là 25oC, 30oC và 37oC, hình ảnh điện di cho thấy protein đích biểu hiện tƣơng ứng với các băng có độ đậm nhƣ nhau. Để rút ngắn thời gian nuôi cấy, chúng tôi chọn điều kiện nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC, nồng độ chất cảm ứng 0.5 mM và thời gian cảm ứng biểu hiện 3 h để sản xuất kháng thể anti-CD47 trong các thí nghiệm tiếp theo.