5. Tính mới của đề tài
3.1. Thiết lập hệ thống vi thủy canh đơn giản, xác định thời gian tạo lỗ
thoáng khí giữa hệ thống và môi trường
* Thí nghiệm 1: Thiết lập hệ thống vi thủy canh đơn giản
Theo nghiên cứu của Tung và cộng sự (2018), các ống giá thể tròn có đường kính 1,5 cm được tạo ra bằng cách dùng màng film nilon (kích thước 20 cm x 30 cm) quấn xung quanh ống nghiệm (có đường kính ngoài là 1,5 cm), vòng tròn nilon được cố định lại bằng nhiệt, ống nghiệm được loại bỏ [23]. Nhằm đơn giản hệ thống vi thủy canh, trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết kế 3 hệ thống vi thủy canh khác nhau gồm: (HT 1) ống nhựa + bông; (HT 2) bọt biển và (HT 3) ống nhựa (hình 3.1a), chồi cây oải hương in vitro
được cắt thành các đoạn dài 3 cm và cấy vào các hệ thống.
Hình 3.1. Thiết kế hệ thống vi thủy canh đơn giản để huấn luyện cây hoa Oải hương lá xẻ in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên
a. (HT 1) ống nhựa + bông; (HT 2) bọt biển và (HT 3) ống nhựa; b. Hệ thống vi thủy canh với giá thể bọt biển; c. Chồi Oải hương in vitro trong hệ thống vi thủy canh; d. Rễ cây Oải hương vi thủy canh sau 10 ngày nuôi cấy; f. tương
18
ứng với chồi oải hương trên hệ thống vi thủy canh (hộp PE + bọt biển) tạo lỗ thoáng khí 5 ngày (bên trái) và 10 ngày (bên phải).
Sau thời gian nuôi cấy 2 tuần, hệ thống vi thủy canh chứa giá thể là bọt biển cho tỷ lệ sống sót cao (hình 3.1b và bảng 3.1). Các chồi Oải hương nuôi cấy trên hệ thống này đều sinh trưởng tốt và ra rễ (hình 3.1 c, d).
* Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian tạo lỗ thoáng khí giữa hệ thống vi thủy canh và môi trường đến tỷ lệ sống (%) của chồi Oải hương.
Trong nghiên cứu của Tung và cộng sự (2017), hệ thống vi thủy canh, sử dụng các loại nắp đậy khác nhau: bao gồm nắp có 3 lỗ thoáng khí (đường kính mỗi lỗ là 0,2 cm và không có màng thoáng khí), nắp có gắn 1 màng Millipore (đường kính màng 2 cm và kích thước lỗ thoáng khí 0,2 µm) và nắp thường (không thoáng khí) [7]. Tuy nhiên, đề tài mới chỉ dừng lại ở mức đánh giá khả năng thoáng khí của các loại nắp đậy. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thử nghiệm nuôi cấy chồi oải hương vào các hệ thống vi thủy canh (bên trên bọc màng thực phẩm PE), xác định thời gian tạo lỗ thoáng khí sau 5, 10, 15 ngày tạo 5 - 7 lỗ thoáng khí, tỷ lệ sống của chồi oải hương được thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian tạo lỗ thoáng khí giữa hệ thống vi thủy canh và môi trường đến tỷ lệ sống (%) của chồi Oải hương Hệ thống Ống nhựa +
bông Bọt biển Ống nhựa
Đặc điểm của mẫu (sau 10 ngày) Hầu hết mẫu bị thối nhũn Mẫu còn xanh và ra rễ Hầu hết mẫu bị thối nhũn 5 ngày 2,5a 2,0a 1,5a 10 ngày 7,0b 85,0a 4,0b 15 ngày 6,8b 88,0a 6,0b
Số liệu trong bảng là giá trị trung bình. Thời gian nuôi cấy: 2 tuần.
Ghi chú: trong cùng một hàng, ký tự theo sau khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê tại α=0,05.
19
Kết quả bảng 3.1 cho thấy hệ thống vi thủy canh chứa giá thể là bọt biển, thời điểm tạo lỗ thoáng khí 10 ngày, 15 ngày cho tỷ lệ cây sống sót cao, lần lượt là 85% và 88%, ở các thời điểm này, rễ đã được hình thành đầy đủ (hình 3.1 d), nếu tạo lỗ thoáng khí ở thời điểm 5 ngày, tỷ lệ sống rất thấp (chỉ đạt 2,0%) (hình 3.1.f), hầu hết chồi hoa oải hương ở các hệ thống còn lại có thân thối nhũn, bộ lá héo rũ. Sự héo rũ của chồi oải hương có thể do nước cung cấp bị giới hạn, tính dẫn của rễ và sự kết nối giữa thân và rễ chưa tốt, nhiều cây mô bị chết trong thời kỳ huấn luyện [11].
Điều kiện thoáng khí của hệ thống nuôi cấy có liên quan mật thiết đến nồng độ CO2, điều này ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng của chồi in vitro,
đặc biệt là quá trình quang hợp. Fujiwara và cộng sự (1987) cho rằng, sự sinh trưởng kém của cây in vitro và cường độ quang hợp thấp có sự liên quan mật thiết đến nồng độ CO2 thấp trong bình nuôi cấy trong suốt quá trình quang hợp [14]. Do đó có thể thấy rằng hệ thống nuôi cấy đảm bảo thoáng khí để làm làm tăng cường độ quang hợp của cây cũng như tăng tỷ lệ sống sót của cây in vitro giai đoạn rèn luyện. Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng cây trồng chứa diệp lục có khả năng quang hợp tăng khi nuôi cấy trên môi trường chứa CO2 [15].
Trong nuôi cấy in vitro, việc sử dụng bình nuôi cấy kín có tác dụng ngăn ngừa sự xâm nhiễm của các vi sinh vật và sự thoát hơi nước. Tuy nhiên, dạng bình nuôi cấy kín có độ ẩm trong bình tương đối cao làm cho cây bị thủy tinh thể, cây phát triển chậm, hình thái sinh lí dị thường dẫn đến tỉ lệ sống sót thấp khi đưa ra vườn ươm [7]. Trong đề tài này, hệ thống vi thủy canh với giá thể bọt biển, phía trên được bao phủ bởi màng PE bọc thực phẩm (hình 3.1 b). Hệ thống vi thủy canh này vẫn đảm bảo là hệ thống nuôi cấy kín nhưng đã được làm thông thoáng. Bước đầu thấy được hệ thống này cải thiện được tỷ lệ sống sót, đồng thời cũng giảm hiện tượng thủy tinh thể của chồi Oải hương in vitro.
20
3.2. Ảnh hưởng của tiền xử lý NAA, bổ sung NAA trực tiếp và dung dịch dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của chồi Oải hương in vitro dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của chồi Oải hương in vitro
Các yếu tố như độ ẩm, CO2, ánh sáng cũng như các chất bổ sung môi trường nuôi cấy đều ảnh hưởng trực tiếp tới sinh trưởng, quang hợp của cây con. Thực vật được nuôi cấy in vitro rất khác biệt so với được nuôi trồng ở ngoài tự nhiên. Mức độ chết cao đã được quan sát thấy trong quá trình chuyển các chồi in vitro ra điều kiện ex vitro do thực vật in vitro có khí khổng không hoạt động, hệ thống rễ yếu và lớp cutin mỏng [16]. Hệ rễ của cây in vitro
thường không thực hiện chức năng khi được chuyển ra môi trường ex vitro
dẫn đến quá trình hấp thụ nước, khoáng thấp là một trong những nguyên nhân làm cho tỷ lệ sống của cây cấy mô giai đoạn huấn luyện thấp.
Chất điều hòa sinh trưởng NAA được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật, chúng có thể kết hợp với các loại hormone khác để định hình sự phát triển của mô thực vật. Việc xử lý chồi Oải hương với NAA bằng cách ngâm trước khi cấy vào dung dịch dinh dưỡng hoặc bổ sung trực tiếp, cũng như dung dịch dinh dưỡng dùng cho thủy canh đều ảnh hưởng tới tỷ lệ ra rễ và sự sinh trưởng của cây Oải hương (hình 3.2 a,b,c,d).
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tiền xử lý NAA, bổ sung NAA trực tiếp và dung dịch dinh dưỡng đến tỷ lệ ra rễ và sự sinh trưởng của chồi oải hương
21
a, b, c, d: rễ cây hình thành trong hệ thống vi thủy canh chứa MS 10%, NAA bổ sung tương ứng 0,0; 0,10; 0,25 và 0,50 (mg/l); e: rễ cây sinh trưởng trong
hệ thống vi thủy canh; f: rễ oải hương in vitro.
Mọi chỉ tiêu theo dõi sau 2 tuần nuôi cấy được ghi nhận ở bảng 3.2 cho thấy ở công thức số 6 bổ sung trực tiếp 0,25 mg/l NAA vào 10% dung dịch MS là tốt nhất (hình 3.2 c). Cụ thể như tỷ lệ ra rễ (88,3%), số rễ/chồi (7,50 rễ), chiều dài rễ (0,52 cm) của chồi Oải hương cao hơn ở các công thức còn lại. Bên cạnh đó, chồi Oải hương được rửa bằng nước cất và nuôi cấy vào hệ thống chứa dung dịch dinh dưỡng MS 50% thì chỉ có 25,3% các cây ra rễ, điều này cho thấy nồng độ MS cao không thích hợp cho sinh trưởng của chồi Oải hương. Kết quả này cũng được ghi nhận trong báo cáo của Đỗ Tiến Vinh và cộng sự (2016) khi nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Oải hương in vitro.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tiền xử lý NAA, bổ sung NAA trực tiếp và dung dịch dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của chồi Oải hương
Công thức Chỉ tiêu CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6 CT 7 Tiền xử lý NAA MS - NAA MS 10% + NAA MS 50% MS 20% 0,0 mg/l 0,1 mg/l 0,25 mg/l 0,5 mg/l Tỷ lệ ra rễ (%) 35,3d 25,3e 34,7d 44,0c 55,3b 88,3a 54,0b Số rễ/ chồi 3,33c 3,33c 2,33c 5,50b 6,67ab 7,50a 3,50c Chiều dài rễ (cm) 0,22c 0,26c 0,28c 0,26c 0,40b 0,52a 0,28c
Chiều cao cây (cm) 4,33a 4,80a 4,60a 4,66a 4,00a 4,33a 4,33a Số lá trên cây 7,20a 7,00a 7,60a 8,25a 8,75a 9,50a 8,00a Chiều dài lá (mm) 8,0ab 7,6ab 8,2ab 8,0ab 7,0b 9,4a 7,2ab Chiều rộng lá (mm) 3,7a 3,2a 3,5a 3,7a 3,5a 4,5a 3,7a
22
Ghi chú: trong cùng một hàng, ký tự theo sau khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê tại α=0,05. Số liệu trong bảng là giá trị trung bình. Thời gian nuôi
cấy: 2 tuần.
Ngoài ra, khi quan sát rễ trên kính hiển vi quang học (Carl zeiss, Đức) vật kính 40X, ở các công thức có dung dịch MS 10% kết hợp NAA lông hút hình thành nhiều (hình 3.2 e), trong khi đó rễ cây in vitro lông hút kém phát triển (hình 3.2 f). Điều này cũng chính là ưu điểm của hệ thống vi thủy canh, lông hút phát triển thuận lợi cho chồi Oải hương hấp thụ nước và muối khoáng khi chuyển sang môi trường tự nhiên.
Ở Việt Nam những công trình nghiên cứu về thủy canh như của Nhựt và cộng sự (2005) đối với đối tượng cây hoa Chuông (Sinninggia speciosa)
[5]; Hoàng Thanh Tùng và cộng sự (2018) đối với cây hoa cúc trắng (Chrysanthemum morifolium) [23] đều ghi nhận kết quả tương tự : hệ thống rễ phát triển mạnh mẽ, hấp thu hiệu quả các chất dinh dưỡng thiết yếu từ dung dịch nuôi cấy dẫn đến năng suất cây trồng tốt hơn.