3. Nội dung nghiên cứu
2.2.4.Xác định hoạt tính protease
Hoạt tính protease từ mầm hạt đậu Nho nhe được định lượng bằng phương pháp của Anson và phản ứng màu được đo ở bước sóng 750 nm dựa vào cường độ màu tạo phức với thuốc nhuộm Folin Ciocalteau [8].
Nguyên lí: Thuốc thử Folin có chứa acid phosphomoipdic và acid phosphoframic, hai chất này phản ứng với gốc tyrosine và triptophan trong phân tử
protein tạo thành phức chất màu xanh da trời hấp phụ cực đại ở bước sóng 750 nm. Như vậy có thể xác định khả năng phân giải polypeptid của protease thông qua tyrosine hoặc triptophan.
Tiến hành đo:
Ống thí nghiệm: 0,5 ml enzyme được hút vào ống nghiệm, để 15 phút ở 40°C, bổ sung 1,0 ml dung dịch casein 1,0%. Hỗn hợp được lắc đều và ủ ở 40°C trong 10 phút thì bổ sung ngay 2,5 ml TCA 5,0%. Hỗn hợp được lắc đều, khoảng 20 phút cho phản ứng dừng lại hoàn toàn, sau đó được li tâm 5 phút với 10000 vòng/phút. 0,5 ml dung dịch trong được hút vào một ống nghiệm khác, bổ sung 2,0 ml dung dịch Na2CO3 6,0% lắc đều. Bổ sung 0,5 ml thuốc thử Folin Ciocalteau 0,2 N và lắc đều, sau 30 phút đo ở bước sóng 750 nm.
Ống đối chứng: 0,5 ml dung dịch enzyme bổ sung với 2,5 ml dung dịch TCA 5,0%, lắc đều, sau đó mới thêm 1,0 ml dung dịch casein 0,5% và tiếp tục làm như trên.
Hiệu số hấp thụ đọc trên máy so màu giữa mẫu thí nghiệm và đối chứng được đối chiếu trên đồ thị tyrosine nồng độ chuẩn.
Hoạt độ của 1ml dung dịch enzyme được tính theo công thức:
Trong đó: x là số đơn vị hoạt độ trong 1,0 ml dịch enzyme, 4: là thể tích của hỗn hợp phản ứng và acid tricloacetic, a: số micromol tyrosine tương đương với hiệu số đọc trên máy giữa ống thí nghiệm và ống kiểm tra, b: Nồng độ pha loãng của dung dịch enzyme, t: thời gian phản ứng.
Xây dựng đường chuẩn: Tyrosine được pha trong 100mM đệm natri acetate pH 5,0 với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 10-100 µg/ml. 1,0ml dung dịch chuẩn được đo ở bước sóng 750 nm. Độ hấp phụ và nồng độ tyrosine được vẽ theo chương trình Excel. Kết quả cho thấy, đường nồng độ chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ từ 10- 100 µg/ml.Đường chuẩn có phương trình y = 0,904x + 0,017 (Hình 2.2). Trong đó, y là độ hấp phụ (OD) ở bước sóng 750 nm, x là nồng độ tyrosine (µg/ml).
Hình 2.2. Đường chuẩn nồng độ tyrosine