pH xác định bằng pH kế (Eutech, 510). Hàm lượng PO43- được xác định thông qua phương pháp Molypdate blue (so màu ở bước sóng 880 nm trên máy Beckman Coulter DU 640B). Mật số vi khuẩn xác định thông qua chỉ số OD.600 nm trên máy quang phổ (Beckman Coulter DU 640B) và phương trình tuyến tính giữa chỉ số OD.600 nm và mật số vi khuẩn [CFU, được đếm bằng phương pháp nhỏ giọt của Hoben và Somasegaran, (1982)]. Số liệu thí nghiệm được xử lý và so sánh ANOVA với phép thử Turkey để tìm ra sự khác biệt trị số trung bình giữa các nghiệm thức bằng phần mềm phân tích thống kê Minitab 16.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4. 1 Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn phân lập
4. 1. 1 Kết quả kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat của 20 dòng vi khuẩn
Bảng 6: Kết quả kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat trong môi trường của 20 dòng vi khuẩn Tên dòng lượngHàm PO43- ban đầu Hàm lượng PO43- còn lại 36 giờ Hiệu suất loại bỏ (%) Tên dòng lượngHàm PO43- ban đầu Hàm lượng PO43- còn lại 36 giờ Hiệu suất loại bỏ (%) TGT018L 19,8 10,4 47,5 KGT004L 20,3 16,8 17,1 TGH003L 19,9 16,6 16,6 CTH010L 19,7 17,9 9,0 TGT025L 19,8 4,6 76,6 AGH006L 20,3 9,0 55,8 STT011L 18,8 17,3 8,0 VLH013L 19,1 8,2 57,3 BTT003L 20,9 14,8 29,0 VLH002L 18,1 16,1 11,0 STH009L 20,3 13,2 35,1 DTT001L 20,5 13,6 33,5 BTT006L 20,7 9,2 55,3 CTT002L 18,2 13,9 24,0 TGT013L 19,7 5,6 71,3 DTT021L 22 20,8 5,6 CTH020L 20,1 13,9 30,7 AGT005L 19,8 15,7 20,7 TVT003L 21,6 20,2 6,4 BLH006L 19,1 14,9 22,0
Kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat của 20 dòng vi khuẩn tích lũy polyphosphat phân lập trong môi trường Fillipe et al., (2001). Kết quả theo dõi và ghi nhận sau 36 giờ cho thấy các dòng vi khuẩn đều có khả năng làm giảm hàm lượng PO43-, trong đó có 5 dòng có khả năng làm giảm mạnh nhất là TGT025L, TGT013L, VLH013L, AGH006L và BTT006L với hiệu suất loại bỏ phosphat hòa tan lần lượt là 76,6; 71,3; 57,3; 55,8; 55,3 % sau 36 giờ nuôi cấy bổ sung vi khuẩn trong môi trường (Bảng 6). Các dòng vi khuẩn này được sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.
4. 1. 2 Kết quả chụp TEM
Kết quả chụp hình vi khuẩn kính hiển vi điện tử truyền quét (TEM) dòng TGT025L cho thấy mối tương quan giữa đặc điểm hình thái và cấu trúc bên trong tế bào Hình 3
(a). Vi khuẩn được nuôi sau 6 ngày trong môi trường tích lũy poly-P, sinh khối ly tâm sử dụng cho chụp TEM. Lớp cắt mỏng (70 nm) có các hạt nhuộm đậm màu điện tử xuất hiện rãi rác khắp tế bào, thể hiện sự hiện diện của các hạt poly-P. Điều này cho thấy dòng TGT025L có khả năng hấp thu phosphat ngoại bào và đồng hóa chúng thành các hạt poly-P dự trữ trong tế bào Hình 3 (b).
Hình 3: Ảnh chụp TEM dòng TGT025L: [(a) (x20,000)], [(b) (x50,000)] 4. 1. 3 Kết quả PCR
Kết quả phân tích PCR với cặp mồi tổng 27F và 1492R nhận diện vi khuẩn tích lũy poly-P cho thấy cả 5 dòng vi khuẩn phân lập đều cho band DNA ở vị trí 1500bp hình 4 (a]. Kết quả nhận diện gen ppk 1 cho kiểu gen ppk 1 dạng IIA phù hợp với nghiên cứu của He và McMahon, (2011), 2 dòng TGT025L và TGT013 cho band DNA gần vị trí 105 bp [hình 4 (b)].
Hình 4: Sản phẩm PCR của 5 dòng vi khuẩn trên gel agarose 1,2 %. (1) Thang
chuẩn DNA 100 bp ladder marker; (2, 9) đối chứng âm; (3, 4, 5, 6, 7) sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA của các dòng vi khuẩn TGT025L, BTT006L, TGT013L, AGH006L và VLH013L; (8) thanh chuẩn DNA marker-C (100 - 1200 bp); (10, 11) sản phẩm PCR đoạn gen ppk 1 dòng TGT013L và TGT025L. Ảnh chụp ngày 25/03/2013 tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - trường Đại học Cần Thơ.
4. 1. 4 Kết quả định danh
Sử dụng chương trình BLASTN để tìm kiếm và xác định trình tự gen 16S rRNA trong ngân hàng gen có độ tương đồng và gần gũi với trình tự 16S rRNA của các dòng vi khuẩn phân lập. Cây phả hệ cho thấy rằng dòng TGT025L gần gũi với giống Kurthia sp. (JQ398850) (Hình 5) với mức tương đồng 99% (Bảng 7)
Hình 5: Cây phả hệ 5 dòng vi khuẩn được xây dựng dựa trên trình tự 16S rRNA
theo phương pháp Maximum Likehood [Chương trình MEGA5.0, (Tamura, 2011)]
Bảng 7: Kết quả định tên các dòng vi khuẩn dựa trên trình tự gen 16S rRNA
Nhóm xếp loại các
dòng Loài có quan hệ gần gũi
Tỉ lệ tương đồng (%) Chiều dài (bp) Bacilli Planococcaceae TGT025L Kurthia sp. (JQ398850) 99 1114 Gamma- proteobacteria Moraxellaceae
TGT013L Acinetobacter radioresistens(GU145275) 99 1277
Bacilli
Gamma-proteobacteria
4. 2 Kết quả kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat trong môi trường tổng hợp4. 2. 1 Sự biến đổi chỉ số pH theo thời gian 4. 2. 1 Sự biến đổi chỉ số pH theo thời gian
Theo dõi sự thay đổi chỉ số pH trong môi trường sau khi cấy bổ sung 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn ở trên vào trong môi trường Fillipe et al. (2001). Kết quả quan sát cho thấy chỉ số pH có sự thay đổi rõ rệt theo thời gian trong các nghiệm thức (Hình 6).
Hình 6: Biến đổi pH theo thời gian của 5 dòng vi khuẩn
Từ Hình 6 cho thấy pH ở các nghiệm thức có xu hướng gia tăng. Trong đó, 3 dòng TGT025L, TGT013L và AGH006L cho thấy chỉ số pH môi trường tăng nhanh và đạt trên 8,0 sau 20 giờ nuôi cấy. Sau đó, pH có xu hướng giảm nhẹ. Filipe et al., (2001) chứng minh rằng sự tăng trưởng và phát triển của PAO, quá trình loại bỏ phosphat, phân hủy PHAs trong điều kiện hiếu khí chịu ảnh hưởng bởi pH. Khi pH thấp ảnh hưởng lên quá trình trao đổi chất của PAB, tốc độ hấp thu phosphat chỉ khoảng 37% ở pH 7,5, bên cạnh đó tốc độ phân hủy PHAs và sự tăng trưởng của PAB giảm đáng kể. pH giảm xuống 6,5 khả năng loại bỏ phosphat trong môi trường giảm theo. Khi pH tăng trên 7,5 sẽ không có ảnh hưởng bất lợi lên PAB, chính vì thế mang lại sự ổn định trong quá trình EBPR.
Hình 7: Sự biến đổi hàm lượng PO43- và chỉ số OD.600 nm theo thời gian: (a) dòng
TGT025L, (b) dòng AGH006L, (C) dòng TGT013L, (d) dòng BTT006L, (e) dòng VLH013L; (f) phương trình tuyến tính giữa chỉ số OD.600 nm và mật số vi khuẩn (CFU).
Năm dòng vi khuẩn đều tăng sinh tốt trên môi trường Filipe et al., (2001) và đạt mật số >108 (CFU) sau hơn 25 giờ nuôi cấy. Trong 10 giờ đầu 3 dòng TGT013L, TGT025L và AGH006L tăng sinh nhanh nhất (OD.600 nm>0,4; tương đương mật số>106 CFU/ml) và khác biệt với 2 dòng BTT006L và VLH013L (OD.60nm>0,2; tương đương mật số>104
CFU/ml). Sự tăng nhanh sinh khối của 3 dòng TGT013L, TGT025L và AGH006L kéo theo hàm lượng phosphat còn lại trong môi trường thấp (hàm lượng PO43- <14 mg/l) và có sự khác biệt với 2 dòng BTT006L và VLH013L (hàm lượng PO43->15 mg/l) [Hình 7 (a), (b), (c), (d), (e)]. Sau 10 giờ các dòng đều có xu hướng tiếp tục tăng sinh và đạt mật số tối đa [OD.600 nm>0,6; tương đương mật số >108 CFU/ml), Hình 7 (f)] sau 25 giờ. Hiệu suất loại bỏ phosphat có sự biến động giữa các dòng vi khuẩn và chúng thể hiện khả năng khác nhau khi cấy bổ sung vào những môi trường khác nhau (Filipe et al.,
(c) (d)
2001). Trong thí nghiệm này, hàm lượng phosphat còn lại trong môi trường của 5 dòng vi khuẩn sau 25 giờ thí nghiệm có khác biệt lớn (Hình 8) và kết quả thể hiện sự tương quan với các kết quả của Fillipe et al. (2001) và Usharani et al., (2011).
Usharani et al., (2011) khi nghiên cứu khả năng loại bỏ phosphat hòa tan của từng dòng vi khuẩn riêng rẽ hay có sự kết hợp giữa ba dòng vi khuẩn lại với nhau cho thấy rằng, đối với từng dòng riêng rẽ thì Pseudomonas sp. YLW-7 có hiệu suất loại bỏ phosphat cao nhất đạt 68%. Trong khi sự kết hợp của 3 dòng Pseudomonas sp. YLW-7, Bacillus
sp. RS-1, Enterobacter sp. KLW-2 thì hiệu suất loại bỏ đạt từ 63,4 đến 92,5% (tùy thuộc vào sự khác biệt về nguồn carbon trong môi trường) sau 72 giờ cấy bổ sung vi khuẩn. Khi so sánh hiệu suất loại bỏ phosphat của từng dòng vi khuẩn trong thí nghiệm, Hình 8 cho thấy rằng 2 dòng TGT025L và TGT013L có ái lực cao trong khả năng hấp thu PO43-
dẫn đến hiệu suất loại bỏ phosphat cao đạt 85,3% đối với dòng TGT025L và 76,6% đối với dòng TGT013L sau 25 giờ cấy bổ sung vi khuẩn, và khác biệt có ý nghĩa thống kê với dòng BTT006L (51%), VLH013L (39,4%) và AGH006L (29,4%). Hai dòng vi khuẩn Acinetobacter radioresistens TGT013L và Kurthia sp. TGT025L được chọn để ứng dụng xử lý phosphat trong nước ao nuôi cá tra.
Hình 8: Hiệu suất loại bỏ phosphat của 5 dòng vi khuẩn sau 25 giờ nuôi cấy trong môi trường tổng hợp. Dòng vi khuẩn có cùng mẫu tự theo sau chỉ sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5% (phép thử Turkey, Minitab 16)
4. 3 Kết quả loại bỏ phosphat trong nước ao nuôi cá tra
4. 3. 1 Sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian trong thí nghiệm qui mô 10 lít
Hai dòng vi khuẩn Acinetobacter radioresistens TGT013L và Kurthia sp. TGT025L được nuôi tăng sinh trong môi trường Fillipe et al. (2001) có hàm lượng PO43- ban đầu
khoảng 21 mg/l. Sau khi nuôi vi khuẩn, một phần lượng PO43- được vi khuẩn sử dụng để tăng sinh và làm giảm nhẹ hàm lượng PO43- dẫn đến có sự khác biệt nhau về hàm lượng PO43- ban đầu giữa các nghiệm thức thí nghiệm và đối chứng (Hình 9).
Hình 9: Biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian
Theo dõi sự biến đổi hàm lượng PO43- trong môi trường theo thời gian và kiểm tra định kỳ sau mỗi 12 giờ thí nghiệm. Kết quả Hình 9 cho thấy hàm lượng PO43- có xu hướng giảm mạnh theo thời gian giữa các nghiệm thức thí nghiệm và có sự khác biệt so với đối chứng. Sau 12 giờ hàm lượng PO43- còn lại trong môi trường ở các nghiệm thức DC, TGT025L, TGT013L và TGT013L + TGT025L lần lượt là 17,6; 8,7; 12,3 và 7,6 mg/l với hiệu suất loại bỏ lần lượt là 17,54; 50,89; 34,29 và 58,30%. Điều này cho thấy rằng hàm lượng PO43- có sự giảm mạnh sau 12 giờ. Sự giảm hàm lượng PO43- tiếp tục được quan sát sau 24 và 36 giờ. Sau 36 giờ hàm lượng PO43- còn lại giữa các nghiệm thức DC, TGT025L, TGT013L và TGT013L + TGT025L lần lượt là 11,6; 4,3; 3,7 và 2,1 mg/l với hiệu suất loại bỏ lần lượt là 45,6; 75,6; 80,0 và 88,7%.
Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy rằng, nghiệm thức có sự phối hợp 2 dòng vi khuẩn cho hiệu quả loại bỏ PO43- tốt nhất. Sự tương tác giữa 2 dòng vi khuẩn TGT013L và TGT025L mang lại kết quả tốt hơn khi bổ sung từng dòng vi khuẩn riêng rẽ và điều này cũng được quan sát bởi Usharani et al., (2011). Tổ hợp 2 dòng vi khuẩn này được sử dụng để xử lý nước ao nuôi cá tra qui mô 100 lít.
4. 3. 1 Sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian trong thí nghiệm qui mô 100 lít
Để hạn chế ảnh hưởng của các chất còn lại trong môi trường nuôi vi khuẩn khi cấy bổ sung vào nước ao nuôi cá tra. Dịch huyền phù vi khuẩn được ly tâm thu sinh khối. Sinh khối hòa vào nước cất vô trùng, sau đó cấy bổ sung vào nước ao nuôi cá tra. Hàm lượng PO43- trong nước ao nuôi cá tra ban đầu khoảng 3,5 mg/l.
Hình 10: Biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian giữa 2 nghiệm thức
Theo dõi sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian giữa 2 nghiệm thức DC và thí nghiệm (TGT025L+TGT013L). Kết quả Hình 8 cho thấy hàm lượng PO43- có xu hướng biến đổi khác nhau giữa 2 nghiệm thức DC và thí nghiệm. Ở nghiệm thức đối chứng có sự tăng nhẹ hàm lượng PO43- sau 24 giờ đầu, sau đó giảm nhẹ và duy trì hàm lượng ở khoảng 4,6 mg/l. Ngược lại, ở nghiệm thức thí nghiệm hàm lượng PO43- giảm theo thời gian. Hiệu quả loại bỏ phosphat trong môi trường ở nghiệm thức thí nghiệm đạt 33,69% sau 24 giờ và 80,9% sau 48 giờ cấy bổ sung vi khuẩn. Hàm lượng phosphat hòa tan còn lại trong môi trường rất thấp [0,7 mg/l, (Hình 10)]. Ở hàm lượng PO43- này sẽ hạn chế sự tăng trưởng và phát triển mạnh mẽ của tảo, nguyên nhân gây ra sự phú dưỡng hóa và hạn chế hàm lượng oxy hòa tan trong nước (Boyd, 1998).
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5. 1 Kết luận
Vi khuẩn tích lũy poly-phosphat là nhóm vi khuẩn có vai trò quan trọng trong xử lý nước thải bằng con đường sinh học. Chúng hấp thu lượng lớn phosphat hòa tan và tích lũy thành poly-phosphat nội bào, góp phần vào quá trình loại bỏ phospho hòa tan trong quá trình xử lý. Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy, các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P được tuyển chọn có hiệu suất loại bỏ phosphat hòa tan cao. Hai 2 dòng vi khuẩn
Acinetobacter radioresistens TGT013L và Kurthia sp. TGT025L cho hiệu quả loại bỏ PO43- cao nhất trong môi trường tổng hợp sau 25 giờ thí nghiệm. Sự loại bỏ PO43- được thực hiện bởi hoạt động của gen ppk 1 dạng IIA trong quá trình chuyển hóa phosphat thành dạng poly-P tích lũy trong tế bào. Tổ hợp 2 dòng vi khuẩn này mang lại hiệu quả loại bỏ phosphat hòa tan trong nước ao nuôi cá tra cao nhất và hàm lượng PO43- còn lại trong môi trường thấp nhất.
Kết quả nghiên cứu đã được đăng trong kỷ yếu hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc diễn ra ngày 27 tháng 9 năm 2013 tại Hà Nội.
5. 2 Đề nghị
Ứng dụng tổ hợp vi khuẩn xử lý phosphat hòa tan trong nước ao nuôi cá tra trong mô hình thực tế.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Dương Tấn Lộc. 2006. Để thị trường cá tra bền vững. Tạp chí khoa học Cần Thơ. 16 , 20- 23.
Huỳnh Trường Giang, Vũ Ngọc Út và Nguyễn Thanh Phương. 2008. Biến động các yếu tố môi trường trong ao nuôi cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh ở An Giang. Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, (1),pp.1-9
Lê Anh Tuấn. 2008. Nước cho nuôi trồng thủy sản trong chiến lược quy hoạch thủy lợi đa mục tiêu ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tạp chí Khoa học - Trường Đại học Cần Thơ, 2, pp. 205-209.
Lê Bảo Ngọc. 2004. Đánh giá chất lượng môi trường ao nuôi cá Tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở xã Tân Lộc, huyện Thốt Nốt, Thành Phố Cần Thơ. Khoa Nông nghiệp và sinh học ứng dụng, Luận văn cao học, Đại học Cần Thơ. Nguyễn Văn Châu. 2008. Bài giảng công nghệ xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản.
NXB Đại học Quốc gia TP. HCM.
Trần Bá Cừ, Nguyễn Thu Hiền, Trần Bá Hoành, Trần Mạnh Kỳ, Đặng Văn Sử, Lê Đĩnh Thái, Nguyễn Văn Thân, Phạm Ngọc Thịnh. 2003. Từ điển bách khoa sinh học, NXB Kỹ thuật, Chương 4.
Tiếng Anh
Ahn J., S. Schroeder, M. Beer, S. Mcllroy, R. C. Bayly, J. W. May, G. Vasiliadis and R. J. Seviour. 2007. Ecology of the Microbial Community removing Phosphate from Wastewater under Continuously Aerobic Conditions in a Sequencing Batch Reactor.
Applied and Environmental Microbiology, 73, pp.2257 - 2270.
Auling G., F. Pilz, H-J. Busse, S. Karrash, M. Streichan and G. Schon. 1991. Analysis of the poly-P accumulating microflora in Prus eliminating, anaerobic-aerobic activated sludge systems by using Diaminopropane as a biomarker for rapid estimation of
Acinetobacter spp. Applied and Environmental Microbiology, pp. 3585-3592.
Barker P. S., P. C. Dold. 1996. Denitrification behavior in biological excess phosphorus removal activated sludge system. Water res, 30, pp. 769-780.
Beer M., H. M. Stratton, P. C. Griffiths and R. J. Seviour. 2006. Which are the polyphosphate accumulating organisms in full scale activated sludge enhanced biological phosphate removal system in Austalia?. Applied of Microbiology, 100, pp. 233-243.
Bond P. L., P. Hugenholtz, J. Keller And L. L. Blackall. 1995. Bacterial community structure of phosphate removing and non-phosphate removing activated sludges from sequencing batch reactor. Applied and Environmental Microbiology, 61(5), pp. 1910-1916.
Bond P. L., R. Erhart, M. Wagner, J. Keller, L. L. Blackall. 1999. Identification of some of the the major groups of bacteria in efficient anf non-efficient biolical phosphorus removal activated sludge systems. Appl. Environ. Microbiol., 65(9), pp. 4077-4088. Boswell C. D., R. E. Dick, H. Eccles and L. E. Macaskie. 2001. Phosphate uptake and