Ở môi trường HS có nồng độ cơ chất 50 g/L, hàm lượng đường giảm đáng kể bắt đầu từ ngày lên men thứ 3 và duy trì không đổi sau khoảng 8 ngày kên men. Hàm lượng đường sót lại trong dịch lên men rất thấp. Điều đáng lưu ý là đối với môi trường 50 g/L, không có sự phát hiện cellulose trong canh trường lên men. Điều này có thể giải thích là do vi sinh vật chỉ sử dụng glucose để tăng sinh khối.
O D 60
60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Day 12 13
Hình 4.7 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L.
120 25 100 20 80 15 60 10 40 5 20 0 0 -5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Day Glucose BC
Hình 4.8 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) và cellulose (g DW/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban
đầu 100 g/L. Gl uc os e (g/ Gl uc os e (g/ B C (g D W
Sự thay đổi hàm lượng đường khử và cellulose của canh trường lên men với nồng độ chất khô ban đầu 100 g/L được thể hiện qua Hình 4.8. Khi hàm lượng đường giảm, tổng hàm lượng vi sinh vật tăng.
Hàm lượng đường giảm mạnh từ ngày 0–5 là do vi sinh vật đang ở pha phát triển bắt đầu sử dụng đường. Kết quả nghiên cứu này cũng tương tự báo cáo của Tsouko et al. (2015) sử dụng vi sinh vật Komagataeibacter sucrofermentans DSM 15973 lên men
sinh tổng hợp cellulose từ bã dầu hướng dương [41]. Báo cáo cho thấy khi lượng đường giảm thì hàm lượng vi sinh vật tăng và thời gian lên men tăng thì hàm lượng vi sinh vật tăng. 250 45 40 200 35 30 150 25 20 100 15 10 50 5 0 0 -5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Day Glucose BC
Hình 4.9 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) và cellulose (g DW/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban
đầu 200 g/L.
Trong nghiên cứu này, việc sử dụng môi trường có hàm lượng cơ chất ban đầu trên 10% mới có khả năng thúc đẩy việc cải thiện sinh tổng hợp cellulose. Kết quả này phù hợp với kết quả của tác giả Jagannath et al. (2008) [42]. Tuy nhiên, tác giả Embuscado et al. (1994) lại kết luận rằng nồng độ chất khô trên 5% không có ảnh hưởng lên sự sinh tổng hợp cellulose [20].
Tiền chất của cellulose trong quá trình lên men của A. xylinum là uridine diphosphoglucose nên sự tổng hợp BC có liên quan tới việc sử dụng cơ chất glucose hoặc fructose là nguồn carbon [12]. Cellulose hình thành có hàm lượng chất khô 1% với khả năng ưa nước và giữ nước tốt [43].
Gl uc os e (g/ B C (g D W
Lượng vi sinh vật, hàm lượng đường và thời gian lên men là ba yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men cellulose vi khuẩn. Hình 4.9 cho thấy hàm lượng đường và thời gian lên men hàm lượng vi sinh vật. Khi hàm lượng đường giảm dẫn đến tổng hàm lượng vi sinh vật tăng và thời gian lên men tăng thì tổng hàm lượng vi sinh vật tăng.
Hàm lượng đường giảm dần từ ngày 0–8 do vi sinh vật đang ở pha tăng trưởng nên nguồn cung cấp carbon ban đầu giảm, vi khuẩn bắt đầu sử dụng acid gluconic trong quá trình trao đổi chất và trong thời gian này độ kết tinh của màng BC tăng dần. Hàm lượng đường từ ngày 0–9 giảm mạnh và từ ngày 9–15 dần ổn định.
Theo tác giả Jagannath et al. (2008), không có sự hình thành cellulose trong giai đoạn đầu của quá trình lên men của vi khuẩn A. xylinum. Cellulose chỉ được hình thành sau ngày thứ 3. Trong suốt thời gian đầu, canh trường lên men trở nên đục hơn [42].
So với nuôi cấy tĩnh, quá trình lên men có khuấy đảo cải thiện sự sinh trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên, phương pháp lên men này lại hạn chế sự hình thành cellulose và cellulose hình thành dưới dạng hạt chứ không phải dạng lớp như nuôi cấy tĩnh [44].
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN
Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men cellulose của vi khuẩn A. xylinum được khảo sát. Nồng độ cơ chất được thay đổi ở các giá trị 50, 100, 200 g/L. Quá trình lên men cellulose được mô tả dựa trên sự thay đổi pH, độ acid tổng, hàm lượng glucose, số lượng vi sinh vật trong canh trường lên men và hiệu suất sinh tổng hợp BC.
Môi trường HS với nồng độ cơ chất 50 g/L không có sự hình thành cellulose là do lượng đường vi sinh vật sử dụng chỉ tăng sinh khối chứ không sản xuất ra cellulose. Sự giảm pH và tăng hàm lượng acid tổng của môi trường 200 g/L cơ chất cao hơn đáng kể so với môi trường 100 g/L. Điều này thúc đẩy việc sinh khối tổng hợp cellulose.
5.2 KHUYẾN NGHỊ
Trong quá trình nghiên cứu, do thời gian thí nghiệm và điều kiện trang thiết bị còn hạn chế nên nghiên cứu vẫn còn nhiều khía cạnh và những khảo sát chưa thực hiện được. Những vấn đề cần được nghiên cứu kỹ hơn trong những nghiên cứu tiếp theo bao gồm: ˗ So sánh các loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose khác;
˗ Tính toán các thông số động học của quá trình lên men;
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] D. N.-S. Hon, “Cellulose: a random walk along its historical path,” Cellulose, vol. 1, no. 1, pp. 1–25, 1994.
[2] P. Béguin and J.-P. Aubert, “The biological degradation of cellulose,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 13, no. 1, pp. 25–58, 1994.
[3] J. Bi et al., “Morphology and structure characterization of bacterial celluloses produced by different strains in agitated culture,” J. Appl. Microbiol., vol. 117, no. 5, pp. 1305–1311, 2014.
[4] D. Klemm, B. Heublein, H. Fink, and A. Bohn, “Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material,” Angew. chemie Int. Ed., vol. 44, no. 22, pp. 3358–3393, 2005.
[5] R. M. Brown Jr, “Cellulose structure and biosynthesis: what is in store for the 21st century?,” J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem., vol. 42, no. 3, pp. 487–495, 2004.
[6] P. Ross, R. Mayer, and M. Benziman, “Cellulose biosynthesis and function in bacteria.,” Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 55, no. 1, pp. 35–58, 1991.
[7] L. R. Lynd, P. J. Weimer, W. H. Van Zyl, and I. S. Pretorius, “Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology,” Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 66, no. 3, pp. 506–577, 2002.
[8] A. Hirai, M. Tsuji, H. Yamamoto, and F. Horii, “In situ crystallization of bacterial cellulose III. Influences of different polymeric additives on the formation of microfibrils as revealed by transmission electron microscopy,”
Cellulose, vol. 5, no. 3, pp. 201–213, 1998.
[9] M. Schramm and S. Hestrin, “Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum,” Microbiology, vol. 11, no. 1, pp. 123–129, 1954.
[10] P. G. Verschuren, T. D. Cardona, M. J. R. Nout, K. D. De Gooijer, and J. C. Van den Heuvel, “Location and limitation of cellulose production by Acetobacter xylinum established from oxygen profiles,” J. Biosci. Bioeng., vol. 89, no. 5, pp. 414–419, 2000.
[11] M. Schramm, Z. Gromet, and S. Hestrin, “Synthesis of cellulose by Acetobacter Xylinum. 3. Substrates and inhibitors,” Biochem. J., vol. 67, no. 4, p. 669, 1957. [12] E. J. Vandamme, S. De Baets, A. Vanbaelen, K. Joris, and P. De Wulf, “Improved
production of bacterial cellulose and its application potential,” Polym. Degrad. Stab., vol. 59, no. 1–3, pp. 93–99, 1998.
[13] M. Iguchi, S. Yamanaka, and A. Budhiono, “Bacterial cellulose—a masterpiece of nature’s arts,” J. Mater. Sci., vol. 35, no. 2, pp. 261–270, 2000.
[14] A. Krystynowicz et al., “Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum,” ACTA Biochim. Pol. Ed., vol. 52,
no. 3, p. 691, 2005.
[15] K. V Ramana, A. Tomar, and L. Singh, “Effect of various carbon and nitrogen sources on cellulose synthesis by Acetobacter xylinum,” World J. Microbiol. Biotechnol., vol. 16, no. 3, pp. 245–248, 2000.
[16] P. R. Chawla, I. B. Bajaj, S. A. Survase, and R. S. Singhal, “Fermentative production of microbial cellulose,” Food Technol. Biotechnol, vol. 47, no. 2, pp. 107–124, 2009.
[17] E. P. Çoban and H. Biyik, “Evaluation of different pH and temperatures for bacterial cellulose production in HS (Hestrin-Scharmm) medium and beet molasses medium,” Afr. J. Microbiol. Res, vol. 5, no. 9, pp. 1037–1045, 2011. [18] S. Tantratian, P. Tammarate, W. Krusong, P. Bhattarakosol, and A. Phunsri,
“Effect of dissolved oxygen on cellulose production by Acetobacter sp,” J. Sci. Res. Chula Univ, vol. 30, pp. 179–186, 2005.
[19] A. Ishikawa, M. Matsuoka, T. Tsuchida, and F. Yoshinaga, “Increase in cellulose production by sulfaguanidine-resistant mutants derived from Acetobacter xylinum subsp. sucrofermentans,” Biosci. Biotechnol. Biochem., vol. 59, no. 12, pp. 2259– 2262, 1995.
[20] M. E. Embuscado, J. S. Marks, and J. N. BeMiller, “Bacterial cellulose. I. Factors affecting the production of cellulose by Acetobacter xylinum,” Topics in Catalysis, vol. 8, no. 5. pp. 407–418, 1994.
[21] D. P. Delmer and Y. Amor, “Cellulose biosynthesis.,” Plant Cell, vol. 7, no. 7, p. 987, 1995.
[22] D. P. Delmer, “Cellulose biosynthesis: exciting times for a difficult field of study,” Annu. Rev. Plant Biol., vol. 50, no. 1, pp. 245–276, 1999.
[23] I. I. Shamolina, “Prospects for use of microbial raw material for fabrication of fibre and film materials. Review,” Fibre Chem., vol. 29, no. 1, pp. 1–8, 1997. [24] R. M. Brown, J. H. Willison, and C. L. Richardson, “Cellulose biosynthesis in
Acetobacter xylinum: visualization of the site of synthesis and direct measurement of the in vivo process,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 73, no. 12, pp. 4565–4569, 1976.
[25] Y.-C. Hsieh, H. Yano, M. Nogi, and S. J. Eichhorn, “An estimation of the Young’s modulus of bacterial cellulose filaments,” Cellulose, vol. 15, no. 4, pp. 507–513, 2008.
[26] A. N. Nakagaito, S. Iwamoto, and H. Yano, “Bacterial cellulose: the ultimate nano-scalar cellulose morphology for the production of high-strength composites,” Appl. Phys. A, vol. 80, no. 1, pp. 93–97, 2005.
[27] E. Trovatti et al., “Novel bacterial cellulose–acrylic resin nanocomposites,”
Compos. Sci. Technol., vol. 70, no. 7, pp. 1148–1153, 2010.
[28] J. Ye et al., “Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum ATCC 23767 using tobacco waste extract as culture medium,” Bioresour. Technol., vol. 274, pp. 518–524, 2019.
[29] Z. Lu, Y. Zhang, Y. Chi, N. Xu, W. Yao, and B. Sun, “Effects of alcohols on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum 186,” World J. Microbiol. Biotechnol., vol. 27, no. 10, pp. 2281–2285, 2011.
[30] L. L. Zhou, D. P. Sun, L. Y. Hu, Y. W. Li, and J. Z. Yang, “Effect of addition of sodium alginate on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum,” J. Ind. Microbiol. Biotechnol., vol. 34, no. 7, p. 483, 2007.
[31] G. L. Miller, “Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar,” Anal. Chem., vol. 31, no. 3, pp. 426–428, 1959.
[32] S. Masaoka, T. Ohe, and N. Sakota, “Production of cellulose from glucose by Acetobacter xylinum,” J. Ferment. Bioeng., vol. 75, no. 1, pp. 18–22, 1993. [33] M. Gullo, C. Caggia, L. De Vero, and P. Giudici, “Characterization of acetic acid
bacteria in ‘traditional balsamic vinegar,’” Int. J. Food Microbiol., vol. 106, no. 2, pp. 209–212, 2006.
[34] K. Kamide, Y. Matsuda, H. Iijima, and K. Okajima, “Effect of culture conditions of acetic acid bacteria on cellulose biosynthesis,” Br. Polym. J., vol. 22, no. 2, pp. 167–171, 1990.
[35] J. H. Ha, N. Shah, M. Ul-Islam, T. Khan, and J. K. Park, “Bacterial cellulose production from a single sugar α-linked glucuronic acid-based oligosaccharide,”
Process Biochem., vol. 46, no. 9, pp. 1717–1723, 2011.
[36] S. Kongruang, “Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum strains from agricultural waste products,” in Biotechnology for Fuels and Chemicals, Springer, 2007, pp. 763–774.
[37] A. Seto, Y. Kojima, N. Tonouchi, T. Tsuchida, and F. Yoshinaga, “Screening of bacterial cellulose-producing Acetobacter strains suitable for sucrose as a carbon source,” Biosci. Biotechnol. Biochem., vol. 61, no. 4, pp. 735–736, 1997.
[38] J. K. Park, S. H. Hyun, and J. Y. Jung, “Conversion ofG. hansenii PJK into non- cellulose-producing mutants according to the culture condition,” Biotechnol. Bioprocess Eng., vol. 9, no. 5, p. 383, 2004.
[39] G. Joseph, G. E. Rowe, A. Margaritis, and W. Wan, “Effects of polyacrylamide- co-acrylic acid on cellulose production by Acetobacter xylinum,” J. Chem. Technol. Biotechnol. Int. Res. Process. Environ. Clean Technol., vol. 78, no. 9, pp. 964–970, 2003.
[40] S. T. Park, E. Kim, and Y. M. Kim, “Overproduction of cellulose in Acetobacter xylinum KCCM 10100 defective in GDP-mannosyltransferase,” J. Microbiol. Biotechnol., vol. 16, no. 6, pp. 961–964, 2006.
[41] E. Tsouko et al., “Bacterial cellulose production from industrial waste and by- product streams,” Int. J. Mol. Sci., vol. 16, no. 7, pp. 14832–14849, 2015.
[42] A. Jagannath, A. Kalaiselvan, S. S. Manjunatha, P. S. Raju, and A. S. Bawa, “The effect of pH, sucrose and ammonium sulphate concentrations on the production of bacterial cellulose (Nata-de-coco) by Acetobacter xylinum,”
[43] S. Yamanaka et al., “The structure and mechanical properties of sheets prepared from bacterial cellulose,” J. Mater. Sci., vol. 24, no. 9, pp. 3141–3145, 1989. [44] R. E. Cannon and S. M. Anderson, “Biogenesis of bacterial cellulose,” Crit. Rev.
Microbiol., vol. 17, no. 6, pp. 435–447, 1991 [45]