4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1.1. Thu VLC từ các môi trƣờng lên men
G. xylinum khi cho vào môi trƣờng nƣớc dừa già sẽ sử dụng các chất dinh dƣỡng trong nƣớc dừa già để tổng hợp nên Cellulose. VLC dày lên dần đến khi môi trƣờng hết chất dinh dƣỡng. Thời gian nuôi cấy khác nhau, ta thu đƣợc VLC có độ dày khác nhau.
Muốn thu VLC (0,3 cm) thì sau khi nuôi cấy tĩnh G. xylinum đƣợc 5 ngày ta tiến hành thu màng.
Muốn thu VLC (0,5 cm ) sau khi nuôi cấy tĩnh G. xylinum 8 ngày
Hình 3.1. VLC nuôi cấy trong 8 ngày
VLC thô sau khi lấy ra khỏi môi trƣờng nuôi cấy có màu trắng đục, rất dẻo dai, đàn hồi tốt, khả năng chịu lực cao.
Hình 3.2. VLC thô sau khi thu 3.1.2. Tạo VLC tinh khiết
17
Bƣớc 1: Tách VLC thô ra khỏi môi trƣờng nuôi cấy, ép bỏ bớt nƣớc Bƣớc 2: Ngâm VLC 48 giờ trong NaOH 3%, rửa và ép
Bƣớc 3: Ngâm tiếp trong HCl 3% trong 48 giờ, sau đó bỏ ra rửa và ép loại bỏ nƣớc.
Bƣớc 4: Ngâm VLC 48 giờ trong nƣớc, sau đó bỏ ra kiểm tra tạp chất Bƣớc 5: Thu VLC đã đƣợc tinh chế
Hình 3.3. VLC 0,5 cm đã đƣợc tinh chế 3.1.3. Phƣơng pháp đánh giá độ tinh khiết củaVLC.
Sau khi kiểm tra độ tinh khiết của màng, không thấy sự xuất hiện kết tủa màu nâu trong dung dịch mẫu thử. Chứng tỏ VLC không có Glucose. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.4
18
3.2. Phƣơng trình đƣờng chuẩn NS trong PBS (pH = 7,4)
Giá trị OD của NS ở bƣớc sóng 277 nm đƣợc trình bày nhƣ trong bảng 3.2.
Bảng 3.1. Mật độ quang của dung dịch Neomycin sufate ở các nồng độ (n = 3) Nồng độ (mg/ml) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Giá trị OD trung bình 0,0049± 0,0001 0,013± 0,001 0,021± 0,0015 0,029± 0,001 0,037± 0,002 0,044± 0,0012
Đo OD của các nồng độ NS khác nhau bằng máy quang phổ UV – 2450 sau đó xử lí bằng phần mềm Excel cho kết quả phƣơng trình đƣờng chuẩn của NS là: Phƣơng trình đƣờng chuẩn: y = 0,1574x – 0,0027 (R2 = 0, 9995) Trong đó: y: Mật độ quang OD (Abs 277nm) x: Nồng độ % NS (mg/ml). R2: Hệ số tƣơng quan.
Phƣơng trình đƣờng chuẩn của thuốc NS trình bày ở hình 3.5.
Hình 3.5. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của thuốc NS
y = 0.1574x - 0.0027 R² = 0.9995 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 0.05 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Mật độ quan g O D ( A bs 277nm )
Nồng độ thuốc Neomycin sunfate (mg/ml)
OD277nm
OD277nm Linear (OD277nm)
19
3.3. Xác định lƣợng thuốc NS nạp vào VLC
VLC sau khi tinh chế ta lấy giấy thấm bỏ 60% nƣớc. Chuẩn bị 3 bình 250 ml, mỗi bình cho NS (2 mg/ml) tiếp tục cho dung dịch đệm PBS (pH= 7,4) đến vạch 100 ml. Cho màng vào dung dịch vừa pha, rung động ở 180 vòng và 400C trong 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ đảm bảo cho màng hấp thụ tối đa. VLCđang hấp thụ thuốc đƣợc thể hiện nhƣ trong hình 3.6
Hình 3.6. VLC đang hấp thụ thuốc NS
VLC sau khi cho vào dung dịch đệm PBS có chứa thuốc NS (2 mg/ml) lắc trong các khoảng thời gian lần lƣợt là 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ lấy dung dịch ra đo quang phổ UV - 2450 để xác định lƣợng thuốc hấp thụ vào màng. Mỗi mẫu đo OD 3 lần, để lấy trung bình mẫu, sử dụng phần mềm Excel để phân tích thống kê số liệu, phân tích phƣơng sai và xác định khoảng tin cậy.
Bảng 3.2. Giá trị OD hấp thụ thuốc NS của VLC (n = 3)
Độ dày màng Thời gian hấp thụ
thuốc Giá trị OD 0,3 cm 1 giờ 0.0342 ± 0.0002 1,5 giờ 0.0316 ± 0.0004 2 giờ 0.0312 ± 0.0002 0,5 cm 1 giờ 0.0396 ± 0.0032 1,5 giờ 0.0372 ± 0.0001 2 giờ 0.037 ± 0.0001
20
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy sau 2 giờ ngâm màng thì giá trị OD đo đƣợc gần nhƣ không giảm, chứng tỏ lƣợng thuốc hấp thụ vào màng đã đạt cực đại.
Khối lƣợng thuốc hấp thụ vào màng và hiệu suất thuốc hấp thụ đƣợc vào màng đƣợc thể hiện trong bảng 3.3
Bảng 3.3. Khối lƣợng, hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC(n=3)
Độ dày màng (cm) Thời gian nuôi cấy (ngày) Thời gian hấp thụ(giờ) m2 (mg) mht(mg/cm3) EE (%) 0,3 6 1 0,234 ± 0,0011 1,766 ± 0,0011 88,29 ± 0,0538 1,5 0,218 ± 0,0009 1,782 ± 0,0009 89,1 ± 0,046 2 0,215 ± 0,001 1,785 ± 0.001 89,23 ± 0,045092 0,5 8 1 0,257 ± 0,0008 1,743 ± 0,0008 87,15 ± 0,0416 1,5 0,254 ± 0,00052 1,746 ± 0,0005 87,31± 0,0261 2 0,253 ± 0,000973 1,747 ± 0,000973 87,37 ± 0,0465
21
Hình 3.7. Khối lƣợng thuốc NS hấp thụ vào VLC( 0,3cm) và VLC(0,5cm) trong 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ
Hình 3.8. Hiệu suất hấp thụ thuốc NS của VLC(0,3cm) và VLC(0,5cm) trong 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ
1.766 1.743 1.782 1.746 1.785 1.747 0 0.5 1 1.5 2
1 giờ 1.5 giờ 2 giờ
kh ố i lượ n g t h u ố c h ấp th u ố c h ấp th ụ (m g)
Thời gian hấp thụ thuốc
VLC 0,3 VLC 0,5 88.29 87.15 89 87.31 89.24 87.37 0 20 40 60 80 100
1 giờ 1,5 giờ 2 giờ
Hi ệu su ất h ấp t h ụ thu ốc ( % )
Thời gian hấp thụ thuốc của VLC
VLC 0,3 VLC 0,5
22
Kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong bảng 3.3, hình 3.7 và hình 3.8 cho thấy:
Hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC tƣơng đối lớn chiếm trên 87% lƣợng thuốc ban đầu đem hấp thu.
Cùng một độ dày màng, thời gian hấp thụ thuốc khác nhau thì khối lƣợng thuốc và hiệu suất hấp thụ thuốc vào màng cũng khác nhau:
- VLC (0,3 cm): Khi cho VLC hấp thu thuốc trong 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ thì khối lƣợng thuốc hấp thụ đƣợc vào VLC lần lƣợt là: 1,766 mg; 1,782 mg; 1,785 mg. Hiệu suất hấp thụ thuốc đƣợc vào VLC lần lƣợt là: 88,29%; 89,1%; 89,23%.
- VLC (0,5 cm): Khi cho VLC hấp thu thuốc trong 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ thì khối lƣợng thuốc hấp thụ đƣợc vào VLC lần lƣợt là: 1,743 mg; 1,746 mg; 1,747 mg. Hiệu suất hấp thụ thuốc đƣợc vào VLC lần lƣợt là: 87.15%; 87,31%; 87,37%.
Cùng một độ dày màng, khi cho VLC hấp thụ thuốc NS trong 1 giờ thì khối lƣợng thuốc và hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC thấp nhất. Khối lƣợng thuốc và hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC cao nhất khi cho VLC hấp thụ thuốc trong 2 giờ.
Trong cùng một khoảng thời gian để VLC hấp thụ thuốc, độ dày VLC có ảnh hƣởng đến khối lƣợng và hiệu suất thuốc NS hấp thụ vào VLC:
- VLC hấp thụ thuốc trong 1 giờ, khối lƣợng và hiệu suất thuốc nạp vào VLC ( 0,3cm), VLC (0,5cm) lần lƣợt là: 1,766mg; 1,743mg; 88,29%; 87,15%
- Khi cho VLC hấp thụ thuốc trong 1,5 giờ, khối lƣợng và hiệu suất thuốc nạp vào VLC lần lƣợt là: 1,782mg; 1,746mg; 89,1%; 87, 31% - Khi cho VLC hấp thụ thuốc trong 2 giờ, khối lƣợng và hiệu suất thuốc nạp vào VLC lần lƣợt là: 1,785mg; 1,747mg; 89,23%; 87,37%
23
Nhƣ vậy, trong cùng một thời gian hấp thụ thuốc thì VLC (0,3cm) hấp thụ thuốc cao hơn VLC (0,5cm). Kết quả này cũng thấy tƣơng tự trong nghiên cứu của các tác giả Bùi Thị Huyền Trang [3], Hoàng Xuân Thủy [6].
24
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Sau khi hoàn thành xong khóa luận, chúng tôi đã thu đƣợc các kết quả nhƣ sau:
- Nuôi cấy và thu đƣợc VLC từ G. xylinum trong môi trƣờng nƣớc dừa già.
- Xử lý, thu đƣợc VLC tinh khiết với độ dày 0,3 cm và 0,5 cm.
- VLC ( 0,3 cm) hấp thụ thuốc cao hơn VLC (0,5 cm) trong cả 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ.
- Sự hấp thụ thuốc NS của VLC đạt hiệu suất nạp thuốc cao nhất là 89,23% với những điều kiện: độ dày màng là 0,3 cm, chế độ lắc 180 vòng, thời gian hấp thụ thuốc trong 120 phút ở 400c
- Sự hấp thụ thuốc NS của VLC đạt hiệu suất nạp thuốc thấp nhất là 87,15% với những điều kiện: độ dày màng là 0,5 cm, chế độ lắc 180 vòng, thời gian hấp thụ thuốc trong 60 phút ở 400c
2. Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc NS của VLC từ chủng
G. xylinus, trên các môi trƣờng khác nhƣ: nƣớc mía, rỉ đƣờng,…
Tiếp tục nghiên cứu khả năng hấp thụ các loại thuốc khác của VLC nhằm tăng tác dụng của các loại thuốc đó.
25
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ Y tế (2007), Dƣợc thƣ quốc gia Việt Nam, Nxb Y học
2. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, trang 450- 452. 3. Bùi Thị Huyền Trang (2017), “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc
famotidin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già”
4. Đinh Thị Kim Nhung (2012), Nghiên cứu thu nhận màng cellulose từ vi khuẩn Acetobacter, ứng dụng trị bỏng, đề tài trọng điểm cấp Bộ giai đoạn 2010 – 2012
5. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thuỳ Vân, Trần Nhƣ Quỳnh (2012), “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, Tạp chí Khoa học
6. Hoàng Xuân Thủy (2018), “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc captopril của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già”
7. Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006), Nghiên cứu các đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng, Tạp chí Dƣợc học, 361, 18 – 20.
8.Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành Hóa sinh học, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội.
9. Nguyễn Văn Thanh (Chủ nhiệm) (2006), “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum”, Đề tài KH&CN cấp Bộ, Bộ Y tế.
10.Nguyễn Xuân Thành, Triệu Nguyên Trung, Phan Thị Huyền Vy, Bùi Minh Thy, Phùng Thị Kim Huệ, (2018) “Tối ƣu hóa hiệu suất nạp thuốc famotidin của vật liệu cellulose vi khuẩn lên men từ dịch trà xanh theo phƣơng pháp đáp ứng bề mặt và mô hình Box-Behnken”, Tạp chí dƣợc học (501), trang 3. và Công nghệ (50), trang 453-462.
11.Phạm Tiệp và Vũ Ngọc Thúy (2009), Thuốc biệt dược và cách sử dụng, NXB Y Hà Nội, trang 639.
26
12. Phan Thị Thu Hồng và cộng sự (2015), “Sử dụng cellulose tổng hợp từ vi khuẩn Acetobacter xylinum để chế tạo vật liệu nhựa composite sinh học trên nền nhựa polyvinyl alcohol”, Tạp chí phát triển KH&CN, 18 (4), trang 114-124.
13. Alguacil J. et al. (2015), “Binding thermodynamics of paromomycin, neomycin, neomycin-dinucleotide and - diPNA conjugates to bacterial and human rRNA”, J Mol Recognit.
14. Almeida I.F. et al. (2014), “Bacterial cellulose membranes as drug delivery systems: An in vivo skin compatibility study”, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 86(3), 332-336.
15. Amita H. Patel L. and Riddhi M. Dave (2015), “Formulation anh evaluation of sustained release in situ ophthalmic gel of neomycin sulphate”, Bulletin of Pharmaceutical Research ;5(1):1-5.
16. Armando JD. et al. (2014),”Do bacterial cellulose membranes have potential in drug-delivery systems”, Expert Opin.
17. Blanchard C. et al. (2015), “Neomycin Sulfate Improves the Antimicrobial Activity of Mupirocin-based Antibacterial Ointments”,
Antimicrob Agents Chemother, pii: AAC,02083-15. 18. Brown R.M. (1999), Pure Appl. Chem. 71.
19. Bworm. E. (2007), Bacterial cellulose Thermoplastic polymer namocomposites, Master of sciencein chaemical engineering, washington state university.
20. Czaja W. et al. (2006), “Microbial cellulose – the natural power to heal wounds”, Biomaterials, 27, 145–151.
21. Czaja W., Young D.J., Kawecki M., Browm R.M. (2007) “The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications”
Biomacromolecules, 8:1–12.
22. Fontana J.D., et al (1990), “Acetobacter cellulose pellicle as a temporary skin substitute”, Appl Biochem Biotechnol, 24–25:253–264. 23. Fukuda M, et al. (2008), “Cimetidine inhibits salivary gland tumor cell
adhesion to neural cells and induces apoptosis by blocking NCAM expression”, Cancer, 10(2407), 8 – 376.
27
24. Hestrin, S.; Schramm, M. (1954). "Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum: II. Preparation of freeze – dried cells capable of polymerizing glucose to cellulose". Biochem. J. 58 (2): 345–352.
25. Jong S.C. et al. (2015), “Novel neomycin sulfate-loaded hydrogel dressing with enhanced physical dressing properties and wound-curing effect”, Drug Deliv.
26. Klemm D. et al. (2009), “Nanocellulose materials – different cellulose, different functionality”, Macromol. Symp, 280, 60–71.
27. Mohd C., et al - Bacterial Cellulose Film Coating as Drug Delivery System
28. Muhammad MA. et al. (2014), “A review of bacterial cellulose-based drug delivery systems: their biochemistry, current approaches and future prospects”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 66, pp. 1047– 1061
29.Nguyen TX. et al. (2014), “Chitosan - coated nano - liposomes for the oral delivery of berberine hydrochloride”, J. Mater. Chem. B, 2, 7149 – 7159.
30. P.A Harris, IM. Leigh and HA Navsaria (1998), “The future for cultured Skin Replacements Buns”, 24 (7), 453 – 457.
31. Pedersoli WM. et al. (1994), “Disposition and bioavailability of neomycin in Holstein calves”, J Vet Pharmacol Ther 17(1),5-11.
32.Selman A., Waksman (1949), "Neomycin-production and antibiotic properties". Journal of Clinical Investigation. 28(5): 934.
33. Selman A., Waksman (1949), "Neomycin-production and antibiotic properties". Journal of Clinical Investigation. 28(5): 934.
34. Wei B. et al. (2011), “ Preparation and evaluation of a kind of bacterial cellulose dry films with antibacterial properties”, Carbohydr Polym , 84, 533–538.