Hợp chất phức thường được t o thành từ các nguy n tố có nhiều đồng vị khác nhau. Điều này t o điều kiện thuận lợi cho việc nhận d ng dễ dàng các mảnh ion.
Giả sử có m t nguy n tố gồm 2 đồng vị A1, A2. Trong phân tử có n nguy n tử của nguy n tố này, khi đó theo l thuyết thì xác suất để có mặt n nguy n tử khác nhau của nguy n tố đó sẽ được t nh như sau:
Số nguy n tử A1 n n-1 n-2 ... n-x ... 2 1 0 Số nguy n tử A2 0 1 2 ... x ... n-2 n-1 n Xác suất 1n p 1 1 2 n np p 2 2 2 1 2 n n C p p ... n 1n x 2x x C p p ... 2 2 2 1 2 n n C p p 1 1 2 n n p p 2n p
Xác suất này là các số h ng khai triển của biểu thức (p1 + p2)n, n x
C là hệ số của nhị thức.
Khi phân tử AnBm với A có 2 đồng vị A1, A2, xác suất tương ứng p1, p2, và B có 2 đồng vị B1, B2, xác suất tương ứng q1, q2. Phân tử có thể được viết (A1)a(A2)b(B1)u(B2)v. Trong đó: a + b = n và u + v = m
Xác suất (XS) các mảnh được t nh như sau [12]
1. 2. 1. 2 n a b m u v a u XS C p p C q q hay XS = ! 1 2 ! 1 2 ! ! ! ! a b u v n m p p q q a b u v 1.6.2. Phƣơng ph p phổ cộng hƣởng từ h t nhân
Cơ sở vật lý của phương pháp c ng hưởng từ h t nhân d a tr n từ t nh của h t nhân: .I. Trong đó: là momen từ h t nhân, là spin h t nhân, I là hệ số từ hồi chuyển.
S tương tác của momen từ h t nhân với m t từ trường ngoài B0 theo định luật cơ học lượng tử dẫn tới m t sơ đồ phân chia mức năng lượng h t nhân. Các h t nhân này, do năng lượng từ của chúng chỉ có thể tồn t i ở những tr ng thái năng lượng giãn cách được gọi là tr ng thái ri ng. Sử dụng m t hệ phát cao tần có thể k ch th ch quá trình chuyển dịch năng lượng của m t h t nhân ri ng lẻ trong khuôn khổ sơ đồ mức năng lượng nói tr n. S hấp thụ năng lượng được ghi l i như m t v ch phổ được gọi là m t t n hiệu c ng hưởng. Theo phương thức tr n người ta có thể ghi được phổ c ng hưởng từ. Tất nhi n m t d ng phổ như vậy chỉ th c hiện đối với những h t nhân có momen từ như: 1
H, 13C, 19F, 31P... Những h t nhân khác nhau sẽ c ng hưởng ở những tần số khác nhau, hay nói cách khác, tr n phổ c ng hưởng từ chúng có đ chuyển dịch hoá học khác nhau.
Cùng m t lo i h t nhân song ở trong các phân tử khác nhau sẽ cho các t n hiệu c ng hưởng và đ chuyển dịch hoá học khác nhau.
1.6.3. Phƣơng ph p đo độ dẫn điện dung dịch
Đ dẫn điện mol là đ dẫn điện của dung dịch chứa m t mol chất điện phân, đặt giữa 2 điện c c song song cách nhau 1cm.
= V. (ohm-1.cm2.mol-1) Trong đó:
- V là đ pha loãng t nh bằng số cm3 dung dịch chứa 1 mol chất tan. - là đ dẫn điện ri ng (S/cm)
Nhờ phép đo đ dẫn điện dung dịch có thể tìm được số lượng ion mà phức chất phân li ra, từ đó giới h n số lượng công thức giả định khi nghi n cứu cấu trúc của 1 phức chất mới.
Đ dẫn điện của dung dịch phức phân li thành 2 ion bằng khoảng 100 ohm-1.cm2.mol-1, của phức phân li thành 3 ion khoảng 250 ohm-1
.cm2.mol-1 , thành 4 ion khoảng 400 ohm-1
.cm2.mol-1. Đối với phức chất có bản chất trung hoà điện thì đ dẫn điện rất bé [7].
1.6.4. Chƣơng trình phổ 1H-NMR mô phỏng
Chương trình ChemNMR trong ChemDraw Ultra 9.0 cho phép d đoán đ chuyển dịch hoá học của tất cả các H và C. Trước ti n chương trình này sẽ nhận d ng
phần cấu trúc ch nh của trinitrotoluen. Mỗi cấu trúc sẽ tương ứng với 1 đ chuyển dịch hoá học. Nếu cấu trúc vòng nào đó không có trong cơ sở dữ liệu thì ChemNMR sẽ sử dụng những vòng gắn vào (thậm ch nó còn phá vỡ vòng) để đưa ra đ chuyển dịch xấp xỉ. ChemNMR xem những phần còn l i của phối tử như là nhóm thế. Đ dịch chuyển hoá học của phân tử sẽ được c ng hoặc bớt đi từ giá trị của những nhóm thế này. Nếu số gia cho những nhóm thế không xác định được thì ChemNMR dùng những đơn vị cấu trúc nhỏ có cùng nguy n tử lân cận nhau để đánh giá.
Chương trình ChemDraw Ultra 9.0 (Calculations - MM2) cho phép tối ưu hoá cấu trúc phân tử bằng cách tối thiểu hoá năng lượng. Trường l c sử dụng ở đây là MM2 hoặc MM3 (áp dụng cho protein). Chương trình sẽ tối ưu hoá cấu trúc đến khi Gradient RMS (root mean square) đ t tới giá trị xác định. Gradient RMS được t nh theo giá trị cho bởi biểu thức:
RMS = 2 1 n i i N
Trong đó ilà khoảng cách giữa 2 cặp electron N là số lượng các cặp nguy n tử
1.6.5. Phƣơng ph p thử ho t tính sinh học
1.6.5.1. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Việc thử ho t t nh kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành theo 2 bước:
Bước 1: Thử định t nh theo phương pháp khuếch tán tr n th ch, sử dụng
khoanh giấy lọc tẩm chất thử theo nồng đ ti u chuẩn.
Bước 2: Các mẫu cho ho t t nh (+) ở bước 1 sẽ được tiến hành thử tiếp ở
bước 2 để t nh ra nồng đ ức chế tối thiểu (MIC) theo phương pháp hiện đ i của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), MCKane, L., & Kandel (1996) tiến hành tr n các phiến vi lượng 96 giếng. Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm: Vi khuẩn Gr (-), vi khuẩn Gr (+), nấm sợi, nấm men.
Kết quả: Đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 370C/24 giờ cho vi khuẩn và 300C/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men.
Kết quả dương tính là nồng đ mà ở đó không có vi sinh vật phát triển. Khi nuôi cấy l i nồng đ này trên môi trường th ch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU<5.
Mẫu thô có giá trị MIC 200 g ml/ được xem là có ho t t nh. Mẫu tinh có giá trị MIC 50 g ml/ được xem là có ho t t nh.
1.6.5.2. Thử khả năng gây độc tế bào
Tế bào ung thư được duy trì li n tục ở các điều kiện ti u chuẩn và được sử dụng test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở các nồng đ khác nhau tr n phiến vi lượng 96 giếng. Phiến thử nghiệm bao gồm: tế bào + môi trường cấy + chất thử, được ủ ở 370C trong 3 ngày để tế bào tiếp tục phát triển. Sau đó tế bào được lấy ra cố định, rửa, nhu m, và hoà l i bằng dung dịch chuẩn, đọc tr n máy Elisa ở bước sóng 495-515nm.
Tính kết quả:
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng đ nào đó của chất thử t nh theo % so với đối chứng. D a tr n kết quả đo được của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi tr n mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức:
Giá trị CS% sau khi t nh theo công thức tr n, được đưa vào t nh toán Excel để tìm ra % trung bình đ lệch ti u chuẩn của phép thử được lặp l i 3 lần theo công thức của Ducan như sau:
2 ( ) 1 i X X n
Các mẫu có biểu hiện ho t t nh (CS <50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50.
Giá trị IC50: dùng giá trị CS của 10 thang nồng đ , d a vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng đ
chất thử để tính giá trị IC50. Công thức: 1 a blnX
y .
Trong đó y là nồng đ chất thử; X: giá trị CS (%)
Các mẫu chiết thô có giá trị: IC50 20 g ml/ được coi là có ho t t nh. Các mẫu chiết tinh có giá trị: IC50 5 g ml/ được coi là có ho t t nh.
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
VÀ KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
- Trong luận văn này chúng tôi nghi n cứu phức t o thành giữa Co(II) với phối tử 4-metylthiosemicacbazon isatin.
- Phối tử 4-metylthiosemicacbazon isatin được tổng hợp từ phản ứng ngưng tụ giữa 4-metylthiosemicacbazit với isatin.
2.2. KĨ THUẬT THỰC NGHIỆM
- Phổ khối lượng được đo tr n máy LC-MSD-Trap-SL (Nhật), Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Đ dẫn điện dung dịch được đo tr n máy EC300, Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Ho t t nh sinh học của phức được đọc tr n máy ELISA ở bước sóng 495-515nm t i Phòng Sinh học Th c nghiệm, Viện Hoá học các hợp chất thi n nhi n, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3. THỰC NGHIỆM 2 3 1 Hóa chất
4-metylthiosemicacbazit (Merck) d ng tinh thể Isatin
Etanol, H2O2
Axit HClO4, HCl, CH3COOH Muối CH3COONa
Muối Co(NO3)2.6H2O Giấy đo pH, nước cất, DMF
2.3.2 Qu trình tổng hợp
2.3.2.1. Tổng hợp 4-metylthiosemicacbazon isatin:
Hoà tan 1,05 gam 4-metylthiosemicacbazit vào hỗn hợp gồm 20 ml nước cất 30 rượu etylic tinh khiết và 1 ml axit axetic khan (dd A) . Hòa tan 1,47 gam isatin vào hỗn hợp 20ml nước cất và 30ml rượu etylic tinh khiết (dd B). Tr n 2 dung dịch với nhau đun hồi lưu ở nhiệt đ 55o
C – 60oC khoảng 100 phút. Để lắng ở nhiệt đ phòng khoảng 1 giờ khi đó có những tinh thể màu vàng hình kim sẽ tách ra. Lọc rửa tinh thể nhiều lần bằng hỗn hợp rượu-nước. Sau đó làm khô trong bình hút ẩm chân không chứa silicagel.
2.3.2.2. Tổng hợp phức chất giữa 4-metylthiosemicacbazon isatin với Co(II)
HIEN 12-7.0
Hòa tan 0,3gam Co(NO3)2.6H2O (khoảng 0,001mol) vào 20ml nước cất (dd A).
Hòa tan 0,24gam (khoảng 0.001mol) 4-metylthiosemicacbazon isatin vào 40ml ancol etylic tinh khiết (dd B).
Tr n hai dung dịch này l i với nhau và điều chỉnh tới pH=7 bằng natriaxetat. Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu khoảng 2h ở 500C. Từ dung dịch sẽ tách ra những tinh thể mịn màu vàng xanh. Để lắng khoảng 1h, lọc thu tinh thể và rửa nhiều lần rồi kết tinh l i từ hỗn hợp DMF-H2O. Sau đó làm khô trong bình hút ẩm chứa silicagel.
HIEN 11 – 4.0
Hòa tan 0.3 gam Co(NO3)2.6H2O (khoảng 0.001 mol) vào 20ml nước cất (dd C).
Hòa tan 0,24 4-metylthiosemicacbazon isatin vào 40ml ancol etylic tinh khiết (dd D).
Tr n hai dung dịch này l i với nhau và điều chỉnh tới pH= 4 bằng HClO4 loãng. Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu khoảng 2h ở 500
C . Từ dung dịch sẽ tách ra những tinh thể mịn màu vàng xanh. Để lắng khoảng 1h, lọc thu tinh thể và rửa nhiều lần rồi kết tinh l i từ hỗn hợp DMF-H2O. Sau đó làm khô trong bình hút ẩm chứa silicagel.
Quá trình tổng hợp các phức tr n được tiến hành nhiều lần, thay đổi điều kiện phản ứng như: thời gian, nhiệt đ đun hồi lưu, pH và thay đổi tỷ lệ mol giữa chúng để tìm điều kiện kết tinh phù hợp nhất.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phối tử 4-metylthiosemicacbazon isatin được t o thành khi th c hiện phản ứng ngưng tụ giữa 4-metylthiosemicacbazit với isatin. Sản phẩm t o thành là những tinh thể màu vàng, ánh kim. Khi t o phức với Co(II) thu được tinh thể màu vàng xanh. Các phức này bền trong không kh , không tan trong nước nhưng tan trong m t số dung môi hữu cơ như đimetylfomamit (DMF), đimetylsunfoxit (DMSO).
3.1 PHỔ KHỐI LƢỢNG VÀ CẤU TRÚC CỦA PHỨC CHẤT
Để xét đoán cấu trúc phân tử của m t hợp chất chưa biết cần phải phân t ch tỉ mỉ phổ khối lượng. Phân t ch phổ khối lượng là quy kết cho mỗi pic tr n phổ m t mảnh phân tử xác định và chỉ rõ s t o thành ion mảnh đó từ đó rút ra những kết luận về cấu t o phân tử. Do đó, chúng tôi sử dụng phổ khối lượng để xác định cấu trúc phức chất.
Hình 3.1 trình bày phổ khối lượng của mẫu HIEN - LINGAND. S xuất hiện cụm pic với m/z = 234, 235, 236 phù hợp với số khối của phân tử C10H10ON4S ứng với các đồng vị khác nhau.
Cụm pic m/z = 219, 220, 221 ứng với ion [C9H7ON4S]+ do s mất đi m t nhóm CH3 và cụm pic m/z = 204, 205, 206 ứng với ion [C9H6ON3S]+ do s mất đi m t nhóm NH-CH3. Cụm pic m/z= 89, 90, 91 ứng với mảnh ion [C2H5N2S]+ và cụm pic m/z = 145, 146 ứng với mảnh ion [C8H5N2O]+.
Ngoài ra trong phổ khối lượng còn xuất hiện pic m/z=77, m/z=65 tương ứng với các mảnh chỉ chứa thành phần hữu cơ: C6H5+, C5H5+. Ngoài ra còn thấy các pic phân mảnh khác xuất hiện trong quá trình bắn phá phân tử phối tử. M t số kết quả t nh toán tỉ lệ giữa các pic được trình bày ở bảng 3.1. Các số liệu cho thấy có s phù hợp cao giữa lý thuyết và th c nghiệm, chứng tỏ s qui kết của chúng tôi là đáng tin cậy. Sơ đồ phân mảnh của mẫu HIEN - LINGAND được đưa ra ở hình 3.2.
Bảng 3.1: Tỉ lệ các pic đồng vị trong cụm pic ion phân tử và ion mảnh
của mẫu HIEN - LINGAND
Các mảnh của mẫu HIEN – LINGAND M (%) M + 1 (%) M + 2 (%) TN LT TN LT C10H10ON4S 234 100 17,42 12,60 5,26 4,58 C9H7O N4S 219 100 11,2 10,39 5,59 4,55 C9H6ON3S 204 100 11,5 11,13 5,3 4,53 C2H5N2S 89 100 8,56 7,91 5,35 4,44 C8H5ON2 145 100 8,50 9,18 0,45 x C6H5 77 100 6,34 6,67 x x C5H5 65 100 5,67 5,87 x x
Hình 3.2 : Sơ đồ phân mảnh của mẫu HIEN-LINGAND
Hình 3.3 trình bày phổ khối lượng của mẫu HIEN11 -4.0 . S xuất hiện cụm pic m/z = 381, 382, 383 phù hợp với công thức của phức [Co(H4methis)(Cl)2(H2O)] ứng với các đồng vị khác nhau.
Hình 3.3: Phổ khối lượng của mẫuHIEN11-4.0
Trong phổ khối lượng xuất hiện pic m/z = 363, 364, 365 ứng với ion [C10H10ON4SCl2Co]+do mất đi m t phân tử H2O và xuất hiện pic m/z = 328, 329, 330 ứng với ion [C10H10ON4SClCo]+ do mất đi m t nguy n tử Cl từ ion phân tử. Mảnh vỡ của phức chất [C10H10ON4SCo]+ mất đi m t nguy n tử Cl làm xuất hiện pic m/z = 293
S phá vỡ m t phần phức dẫn đến s xuất hiện của pic m/z = 234,235,236 ứng với ion [C10H10ON4S]+(ion phối tử). Từ mảnh này mất đi m t nhóm CH3 làm xuất hiện pic m/z = 219 ứng với ion [C9H7ON4S]+, mất đi m t nhóm
(CH3-NH-CS-NH) làm xuất hiện pic m/z = 145 ứng với ion [C8H5ON2]+. Ngoài ra còn thấy các pic phân mảnh khác xuất hiện trong quá trình bắn phá phân tử phức. M t số kết quả t nh toán tỉ lệ giữa các pic được trình bày ở bảng 3.2. Các số liệu cho thấy có s phù hợp cao giữa lý thuyết và th c nghiệm, chứng tỏ s qui kết của chúng tôi là đáng tin cậy. Sơ đồ phân mảnh của mẫu HIEN11-4.0 được đưa ra ở hình 3.4.
Bảng 3 2: Tỉ lệ các pic đồng vị trong cụm pic ion phân tử và ion mảnh
của mẫu HIEN11-4.0
Các mảnh của mẫu HIEN11-4.0 M (%) M + 1 (%) M + 2 (%) TN LT TN LT C10H12O2N4SCl2Co 381 100 15,65 22,41 72,17 74,82 C10H10ON4SCl2Co 363 100 16,43 22,41 72,60 74,82 C H ONSClCo 328 100 12,19 22,41 39,02 37,91
C10H10ON4S 234 100 13,37 12,6 5,53 4,58 C9H7ON4S 219 100 13,83 10,39 5,32 4,55
C8H5ON2 145 100 9,85 9,18 x x
TN: thực nghiệm LT: lí thuyết x: bỏ qua (quá nhỏ)
Hình 3.5 trình bày phổ khối lượng của mẫu HIEN12-7.0. S xuất hiện cụm pic m/z = 525,526,527 phù hợp với số khối phân tử phức Co(H4methis)2 ứng với các đồng vị khác nhau.
Hình 3.5 : Phổ khối lượng của mẫu HIEN12-7.0
Trong phổ khối lượng xuất hiện pic m/z = 510, 511, 512 ứng với ion
[C19H17O2N8S2Co]+ do mất đi m t nhóm –CH3 từ ion phân tử và xuất hiện pic m/z = 495, 496, 497 ứng với ion [C19H16O2N7S2Co]+ do mất đi nhóm –NH-CH3 từ