Yêu cầu kỹ thuật

3.2. Kết quả xây dựng TCCS của dược liệu Bù ốc leo

3.2.1.Yêu cầu kỹ thuật

3.1.2. Kết quả xác định đặc điểm vi phẫu

3.1.2.1. Vi phẫu thân

Vi phẫu thân có thiết diện tròn, quan sát trên kính hiển vi (Hình 3.2) thấy từ ngoài vào trong có các đặc điểm: biểu bì (2) gồm một lớp tế bào hình chữ nhật hoặc hình đa giác 5 - 6 cạnh có kích thước khá đều nhau, cutin mỏng. Vỏ ngoài có lông che chở đơn bào (1). Mô mềm vỏ (3) gồm 10 - 12 lớp là những tế bào hình đa giác kích thước khác nhau, xếp xít nhau, không đều. Nằm rải rác trong phần vỏ và mô mềm ruột là tinh thể calci oxalat hình cầu gai (4). Phần trụ bì nằm phía trong phần vỏ có các đám sợi tập trung bắt sáng (5), xếp thành vòng tròn trên thiết diện cắt ngang vi phẫu thân. Tiếp đến là bó libe gỗ (6) và mạch gỗ rất phát triển (7). Trong cùng là mô mềm ruột (8), gồm những tế bào hình gần tròn có vách mỏng.

21

Hình 3. 2. Hình ảnh vi phẫu thân Bù ốc leo

1. Lông che chở; 2. Biểu bì; 3. Mô mềm vỏ; 4. Đám sợi; 5. Libe; 6. Gỗ; 7. Mô mềm

ruột; 8. Tinh thể calci oxalat.

3.1.2.1. Vi phẫu lá

Quan sát trên kính hiển vi thấy (Hình 3.3), hình ảnh vi phẫu lá Bù ốc leo có tính đối xứng, từ trên xuống dưới gồm các phần: lông che chở đơn bào (1), lớp tế bào biểu bì trên gân chính (2), mô mềm trên và dưới (3,6), bó libe (4) và mạch gỗ (5) phát triển . Rải rác trong phần mô mềm là các tinh thể calci oxalat (7), dưới cùng là lớp tế bào biểu bì dưới gân chính (8).

22

Hình 3. 3. Hình ảnh vi phẫu lá Bù ốc leo

1. Lông che chở; 2. Tế bào biểu bì trên gân chính; 3, 6. Mô mềm; 4. Libe; 5. Gỗ; 7. Tinh thể calci oxalat; 8. Tế bào biểu bì dưới gân chính.

3.1.3. Kết quả xác định đặc điểm bột dược liệu

Bột dược liệu Bù ốc leo có màu lục vàng nhạt, mùi đặc trưng, vị hơi đắng. Quan sát trên kính hiển vi (Hình 3.4) thấy có các đặc điểm sau: Bó sợi (1,2), sợi dài (5); các mảnh mạch: mạch điểm chứa tinh thể calci oxalat (3), mạch điểm (4), mảnh mạch (9), mảnh bần (10,11) và tế bào bần (6); khối nhựa có màu đỏ nâu (12); tinh thể calci oxalat (7,8).

23

Hình 3. 4. Đặc điểm bột dược liệu Bù ốc leo

1,2. Bó sợi; 3. Mảnh điểm chứa tinh thể calci oxalat; 4. Mạch điểm; 5. Sợi; 6. Tế bào

bần; 7,8. Tinh thể calci oxalat; 9. Mảnh mạch; 10,11. Mảnh bần; 12. Khối nhựa

3.1.4. Kết quả định tính

3.1.4.1. Định tính bằng phản ứng hóa học

Sau khi tiến hành như mô tả ở mục 2.4.4.1, thu được kết quả như trình bày ở bảng 3.1:

Bảng 3. 1. Kết quả định tính dược liệu Bù ốc leo bằng phản ứng ống nghiệm

Phản ứng

Kết quả Kết luận

Phản ứng của saponin

Phản ứng Salkowski Xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt ngăn cách Phản ứng dương tính

Phản ứng của flavonoid

Phản ứng với kiềm Dung dịch chuyển màu vàng đậm hơn Phản ứng dương tính

24

Phản ứng Cyanidin Dung dịch chuyển màu hơi đỏ Phản ứng dương tính

Phản ứng với FeCl3 Dung dịch chuyển màu xanh đen Phản ứng dương tính (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

3.1.4.2. Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

25

Hệ 1: diclomethan : methanol (9:1, v/v)

Hệ 2: cloroform : ethyl acetat : methanol : nước (2:4:2:1, v/v/v/v, lớp dưới)

Hệ 3: aceton – nước (3:1, v/v)

26

1, 2, 3: các mẫu dược liệu Bù ốc leo; A: Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm; B: Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm; C: Phun thuốc

thử H2SO4 10%/EtOH, quan sát dưới ánh sáng thường.

3.1.5. Kết quả xác định độ ẩm

Tiến hành như mô tả ở mục 2.5, thu được kết quả như tình bày ở bảng 3.2:

Bảng 3. 2. Độ ẩm của dược liệu Bù ốc leo

Lần thí nghiệm

Khối lượng dược liệu trước khi sấy (g)

Khối lượng dược liệu sau khi sấy (g)

Độ ẩm (%) M ± SD (%) 1 1,014 0,8841 12,81 12,81 ± 0,02 2 1,023 0,8922 12,79 3 1,007 0,8778 12,83

Độ ẩm của dược liệu Bù ốc leo khoảng từ 12.79% đến 12.83%. Như vậy, dự kiến độ ẩm của dược liệu Bù ốc leo không quá 13%.

3.1.6. Kết quả xác định tro toàn phần

Tiến hành như mô tả ở mục 2.6., kết quả xác định tro toàn phần của các mẫu dược liệu Bù ốc leo được trình bày ở bảng 3.3:

Bảng 3. 3. Tro toàn phần của dược liệu Bù ốc leo

Lần thí nghiệm

Khối lượng dược liệu (g)

Khối lượng tro (g)

Tỷ lệ tro toàn phần (%) M ± SD (%) 1 1,011 0,0583 5,77 5,79 ± 0,07 2 1,013 0,0594 5,86 3 1,004 0,0576 5,74

Tỉ lệ tro toàn phần của dược liệu Bù ốc leo khoảng từ 5,74% đến 5,86%. Như vậy, dự kiến giới hạn tro toàn phần không quá 6%.

3.1.7. Kết quả xác định tro không tan trong acid

27

Bảng 3. 4. Tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu Bù ốc leo

Lần thí nghiệm

Khối lượng dược liệu (g)

Khối lượng tro không tan trong acid (g) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Tỷ lệ tro không tan trong acid (%)

M ± SD (%) 1 1,011 0,0214 2,12 2,14 ± 0,05 2 1,013 0,0223 2,20 3 1,004 0,0211 2,10

Tỉ lệ tro không tan trong acid của dược liệu Bù ốc leo khoảng từ 2,10% đến 2,20%. Như vậy, dự kiến giới hạn tro không tan trong acid không quá 2,5%.

3.1.8. Hàm lượng chất chiết được trong dược liệu

Sau khi tiến hành như mô tả ở mục 2.8., kết quả xác định hàm lượng chất chiết được trong EtOH 70% và trong nước của Bù ốc leo được trình bày ở bảng 3.5 và 3.6:

Bảng 3. 5. Hàm lượng chất chiết được trong nước

Lần thí nghiệm Độ ẩm (%) Khối lượng dược liệu (g) Khối lượng cắn (g)

Chất chiết được trong nước (%) M ± SD (%) 1 12,81 1,999 0,1425 16,35 16,29 ± 0,15 2 12,79 2,003 0,1404 16,07 3 12,83 2,002 0,1434 16,43

Hàm lượng chất chiết được trong nước của dược liệu Bù ốc leo khoảng từ 16,07% đến 16,43%. Như vậy, dự kiến hàm lượng chất chiết được trong nước của dược liệu Bù ốc leo không ít hơn 16%.

Bảng 3. 6. Hàm lượng chất chiết được bằng EtOH 70%

Lần thí nghiệm Độ ẩm (%) Khối lượng dược liệu (g) Khối lượng cắn (g)

Chất chiết được trong EtOH 70% (%) M ± SD (%) 1 12,81 2,000 0,1463 16,78 16,80 ± 0,04 2 12,79 2,000 0,1470 16,86 3 12,83 1,999 0,1461 16,77

Hàm lượng chất chiết được trong EtOH 70% của dược liệu Bù ốc leo khoảng từ 16,77% đến 16,86%. Như vậy, dự kiến hàm lượng chất chiết được trong EtOH 70% của dược liệu Bù ốc leo không ít hơn 16%.

28

3.1.9. Kết quả định lượng saponin tổng số bằng phương pháp cân

Sau khi tiến hành như mô tả ở mục 2.9., kết quả xác định hàm lượng saponin tổng số của dược liệu Bù ốc leo được trình bày ở bảng 3.7:

Bảng 3. 7. Hàm lượng saponin tổng số trong dược liệu Bù ốc leo

Lần thí nghiệm Độ ẩm (%) Khối lượng dược liệu (g) Khối lượng cắn saponin (g)

Hàm lượng saponin toàn phần (%) M ± SD (%) 1 12,81 1,000 0,0524 6,01 6,03 ± 0,05 2 12,79 0,997 0,0521 5,99 3 12,83 1,001 0,0532 6,10

Hàm lượng saponin tổng số trong dược liệu Bù ốc leo xác định bằng phương pháp cân khoảng từ 5,99% đến 6,10%. Như vậy, dự kiến hàm lượng saponin trong dược liệu không ít hơn 6,0%

3.2. Kết quả xây dựng TCCS của dược liệu Bù ốc leo

3.2.1. Yêu cầu kỹ thuật

3.2.1.1. Mô tả

Dược liệu có mùi hăng, phần thân khô có màu nâu hoặc xám xanh, giòn, xốp. Phần lá có màu xám.

Lá tươi Bù ốc leo có hình trứng hơi tròn, mũ nhọn, gốc hình tim nông.

3.2.1.2. Vi phẫu

Vi phẫu thân:

Vi phẫu dược liệu có thiết diện hình tròn, từ ngoài vào trong có các đặc điểm: vỏ ngoài có lông che chở; libe gỗ và mạch gỗ rất phát triển; mô mềm ruột và vỏ chứa nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai.

Vi phẫu lá:

Vi phẫu lá đối xứng, gân phía trên và gân phía dưới đều lồi, gân phía dưới lồi nhiều hơn, vỏ ngoài có lông che chở. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

3.2.1.3. Soi bột

Bột dược liệu có màu lục vàng nhạt, mùi đặc trưng, vị đắng. Quan sát bằng kính hiển vi thấy các đặc điểm: mảnh điểm chứa tinh thể calci oxalat, bó sợi, tế bào sợi, tinh thể calci oxalat nằm rải rác.

3.2.1.4. Độ ẩm

Không quá 13,0%.

3.2.1.5. Tro toàn phần

29

3.2.1.6. Tro không tan trong acid

Không quá 2,5%.

3.2.1.7. Chất chiết được trong dược liệu

Chất chiết được trong dược liệu trong nước không ít hơn 16%.

Chất chiết được trong dược liệu trong ethanol 70% không ít hơn 16%.

3.2.1.8. Định tính:

Dược liệu phải thể hiện phép thử định tính của saponin và flavonoid

3.2.1.9. Định lượng:

Hàm lượng saponin tổng số xác định bằng phương pháp cân không được dưới 6,0% tính theo dược liệu khô kiệt.

3.2.2. Phương pháp thử

3.3.2.1. Mô tả:

Kiểm tra hình thái, màu sắc, mùi vị bằng cảm quan, kiểm tra kích thước bằng cách đo trực tiếp, dược liệu phải đạt các yêu cầu đã nêu ở trên.

3.2.2.2. Vi phẫu:

Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.18 – Định tính dược liệu và các chế phẩm bằng kính hiển vi. Dược liệu được cắt thành lát cắt ngang, nhuộm kép và quan sát dưới kính hiển vi, phải thấy các đặc điểm như đã mô tả.

3.2.2.3. Bột:

Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.18 – Định tính dược liệu và các chế phẩm bằng kính hiển vi. Nghiền dược liệu khô thành bột mịn rồi quan sát dưới kính hiển vi trong 1 giọt dung dịch soi, phải thấy các đặc điểm như đã mô tả.

3.2.2.4. Độ ẩm:

Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.6, 1g, 105oC, 4 giờ.

3.2.2.5. Tro toàn phần:

Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.8.

3.2.2.6. Tro không tan trong acid:

Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.7.

3.2.2.7. Chất chiết được trong dược liệu

Cân chính xác khoảng 2,000 g bột dược liệu, cho vào bình nón 250 ml. Thêm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

chính xác 50,0 ml dung môi, đậy kín, cân xác định khối lượng, để yên 1 giờ, sau đó đun hồi lưu cách thủy sôi nhẹ 1 giờ, để nguội, lấy bình nón ra, đậy kín, cân để xác định lại khối lượng, dùng dung môi để bổ sung phần khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 25 ml dịch lọc cho vào một cốc thuỷ tinh đã cân bì trước, cô trong cách thủy đến cắn khô. Sấy cắn ở 105ºC trong 3

30

giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn sau khi sấy

𝑋(%) = 2 × 𝑎 × 100

𝑏 × (100 − 𝑥) × 100%

Trong đó: X: hàm lượng chất chiết được trong EtOH 70% hoặc trong nước (%) a: khối lượng cắn (g)

b: khối lượng dược liệu (g) x: độ ẩm của dược liệu (%)

3.2.2.8. Định tính

a. Định tính bằng phản ứng ống nghiệm

Định tính saponin:

- Phản ứng Salkowski: Cho vào bình nón 2 g dược liệu, thêm 20 ml EtOH 90% đun sôi cách thủy. Lọc lấy dịch lọc và cho vào một ống nghiệm, bốc hơi dịch lọc đến cắn. Hòa tan cắn trong 1 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Dùng pipet nhỏ từ từ 1-2 ml H2SO4 vào thành ống nghiệm. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt ngăn cách.

Định tính flavonoid:

- Phản ứng với kiềm cho 2 ml dịch chiết EtOH vào một ống nghiệm, cho thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, màu vàng đậm hơn thì phản ứng dương tính.

- Phản ứng Cyanidin cho 2 ml dịch chiết EtOH vào một ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại, rồi thêm 3 – 5 giọt acid HCl đậm đặc, đun nóng cách thủy sau vài phút thấy xuất hiện màu tím đỏ thì phản ứng dương tính.

- Phản ứng với FeCl3 cho 2 ml dịch chiết EtOH vào một ống nghiệm, thêm 2-3 giọt FeCl3 5%, thấy dung dịch có màu xanh đen thì phản ứng dương tính.

b. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (DĐVN V, phụ lục 5.4).  Thuốc thử, dụng cụ:

Bản mỏng: bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck), bản mỏng silical gel 60 RP –

18 F254S (Merck), hoạt hóa ở 105℃ trong 30 phút.

Hệ dung môi khai triển:

+ Hệ 1: dicloromethan - methanol (9:1, v/v);

+ Hệ 2: cloroform - ethyl acetat - methanol - nước (2:4:2:1, v/v/v/v, lớp dưới) + Hệ 3: aceton – nước (3:1, v/v).

Thuốc thử hiện vết: Dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol.

31

Dung dịch thử: 3 mẫu dịch chiết dược liệu Bù ốc leo bằng EtOH 70% trong 1

giờ.

Cách tiến hành: chấm riêng biệt 10 l mỗi dung dịch mẫu thử lên bản mỏng,

tiến hành sắc ký theo DĐVN V, phụ lục 5.4. Sau khi khai triển hệ dung môi được 8 cm, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng rồi phun thuốc thử hiện vết. Sấy bản mỏng ở 105℃ cho đến khi hiện rõ vết, quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường và ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm.

3.2.2.9. Định lượng saponin tổng số bằng phương pháp cân

Cân chính xác khoảng 1,000 g bột dược liệu, chiết hồi lưu ở 70oC 3 lần, mỗi lần 50 ml EtOH 70% trong 1 giờ. Lọc thu dịch chiết. Cất thu hồi dung môi đến cắn. Hòa tan cắn với 50 ml nước cất. Sau đó chiết lỏng - lỏng với khoảng n-hexan 3 lần,

mỗi lần 50 ml để loại chất béo. Dịch chiết nước sau khi chiết với n–hexan tiếp tục (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

chiết lỏng – lỏng với n-butanol 3 lần, mỗi lần 50 ml. Gộp các dịch chiết n-butanol, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn. Hòa tan cắn bằng 20 ml EtOH 70% rồi chuyển sang cốc có mỏ đã xác định khối lượng. Cô cách thủy thu được cắn. Sấy khô cắn ở 105oC đến khối lượng không đổi.

𝑋(%) = 2 × 𝑎 × 100

𝑏 × (100 − 𝑥) × 100%

Trong đó: X: hàm lượng chất chiết được trong EtOH 70% hoặc trong nước (%) a: khối lượng cắn (g)

b: khối lượng dược liệu (g) x: độ ẩm của dược liệu (%)

3.2.3. Đóng gói và bảo quản

- Dược liệu được bảo quản trong túi nilong kín, có nhãn rõ ràng, đúng quy chế. - Bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát.

3.3. Bàn luận

 Về khảo sát các chỉ tiêu chất lượng cho dược liệu Bù ốc leo

Nghiên cứu này tiến hành khảo sát các chỉ tiêu đánh giá chất lượng của dược liệu Bù ốc leo theo các tiêu chí chung được quy định trong DĐVN V, bao gồm: mô tả, vi phẫu, soi bột, tro toàn phần, tro không tan trong acid, chất chiết được trong EtOH 70%, chất chiết được trong nước, định tính nhóm chất flavonoid và saponin bằng phản ứng ống nghiệm, định tính bằng TLC, hàm lượng saponin tổng số. Dược liệu Bù ốc leo chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá chất lượng, cũng chưa có chuyên luận riêng

32

trong Dược điển. Do đó, kết quả của nghiên cứu này góp phần tạo cơ sở dữ liệu cho việc nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng cho dược liệu này.

Độ ẩm là hàm lượng ẩm trong dược liệu sau khi đã phơi hoặc sấy khô. Độ ẩm của dược liệu Bù ốc leo theo thực nghiệm là 12,81%. Kết quả này khá tương đồng với kết quả xác định của Purushoth Prabhu T. và cộng sự thực hiện, độ ẩm của dược liệu này là 11,25%.

Tro toàn phần dùng để đánh giá các tạp chất lẫn trong dược liệu. Tạp chất này có thể có nguồn gốc là chất vô cơ có sẵn trong tế bào thực vật hoặc các tạp chất ngoại lai như đất, cát trên bề mặt dược liệu bị lẫn vào. Tỉ lệ tro toàn phần của dược liệu Bù ốc leo theo thực nghiệm là 5,79%. Dược điển Việt Nam V không quy định về giới hạn cho chỉ tiêu này. Đối chiếu với nghiên cứu về tiêu chuẩn Bù ốc leo đã được Purushoth Prabhu T. và cộng sự thực hiện, tỉ lệ tro toàn phần của mẫu dược liệu Bù ốc leo thu hái ở Tamil Nadu, Ấn Độ là 18%. Có thể thấy tỉ lệ tro toàn phần của mẫu dược liệu Bù ốc leo sử dụng trong nghiên cứu này thấp hơn, chứng tỏ thành phần tạp chất vô cơ trong dược liệu được lấy ở Lai Châu, Việt Nam thấp hơn mẫu dược liệu được lấy ở Tamil Nadu, Ấn Độ.

Tạp chất trong dược liệu gồm chất vô cơ có sẵn trong tế bào thực vật, hoặc những tạp đất cát dính trên dược liệu trước khi được xay nhỏ. Chỉ tiêu tro không tan trong acid đánh giá các tạp Silic và đất cát dính trên dược liệu. Tỉ lệ tro không tan