Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch dược sử dụng bao gồm:
+ Bình chiết 30 lít
+ Máy cô quay chân không
+ Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 365 nm + Tủ sấy chân không
+ Máy sấy + Micropipet
+ Bình sắc ký loại phân tích và điều chế
+ Cột sắc ký pha thường và phao đảo các loại đường kính + Dung dịch thuốc thử H2SO4 10%
+ Bếp điện
2.2.4. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của hợp chất
+ Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy BRUKER Avante 500 với chất chuẩn nội TMS (Tetrametyl Silan) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
+ Máy đánh siêu âm POWERSON IC 603 của hãng Hwashin Technology, Korea.
+ Cân phân tích 4 số Ohaus P124 của hãng Ohaus Corporation, USA. + Máy cất quay chân không.
+ Tủ hút chân không.
+ Đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm.
+ Silica gel 60 (0,04 – 0,063 mm) Merck
+ Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30 – 50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd) + Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC – Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) + Bản mỏng tráng sẵn pha đảo PR18 F254s (Merck)
+ Bản mỏng điều chế pha thường DC - Alufolien 60 F254 (Merck)
+ Các loại dung môi hữu cơ như acetone, ethyl acetate, hexan, methanol, water, dichloromethane, v.v...
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất
3.1.1. Chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn
Thân lá Bùm bụp (M. apelta) được rửa sạch, phơi khô, làm nhỏ. Cân 5 kg mẫu đã làm nhỏ và được ngâm chiết với 20L dung môi methanol kết hợp với siêu âm ở nhiệt độ phòng trong 10 giờ, rút lấy dịch chiết lần một. Bổ sung thêm dung môi ngập dược liệu 2-3cm (20L/lần) và tiếp tục chiết thêm hai lần, thu được dịch chiết lần hai và lần ba.
Gộp dịch chiết 3 lần, lọc các dịch chiết methanol thu được qua giấy lọc đem cất thu hồi methanol dưới áp suất giảm thu được khoảng 568 g cao chiết tổng methanol (MA).
Hòa tan 500g cao đặc trong nước ấm, tỷ lệ thể tích cao đặc: nước cất ấm (1:1) thu được dịch chiết nước. Dịch chiết nước đem chiết với dung môi
dichloromethane, tỷ lệ thể tích dichloromethane: nước ấm (1:1) chiết lặp lại 3 lần, mỗi lần 500ml dung môi trong 30 phút. Phân đoạn dịch chiết thu được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách thủy ở nhiệt độ 600C đến cặn. Cặn chiết này được phân bố đều trong nước cất và chiết với CH2Cl2 thu được cặn CH2Cl2 (1A, 250
g) và lớp nước (1B, 318 g).
3.1.1. Phân lập các hợp chất
Phần nước 1B được cất loại bỏ dung môi hữu cơ, sau đó đưa lên cột sắc ký trao đổi ion với chất hấp phụ là Diaion HP-20 với hệ dung môi tăng dần nồng độ methanol trong nước (25, 50, 75, 100%) thu được 4 phân đoạn 2A (15g), 2B (10g), 2C (6g) và
2D (7g).Phân đoạn 2C được chạy sắc ký trên cột silica gel pha thuận với hệ dung môi gradien CH2Cl2:MeOH (20:1→0:1) thu được 4 phân đoạn nhỏ hơn ký hiệu là 3A (500 mg), 3B (700 mg), 3C (1,2 g) và 3D (1 g). Phân đoạn 3C được tiến hành sắc ký qua cột RP-18 với hệ dung môi acetone:H2O (1:1,5) thu được 5 phân đoạn nhỏ hơn ký hiệu là
4A (120 mg), 4B (150 mg), 4C (300 mg), 4D (50 mg) và 4E (150 mg). Hợp chất MA1
(30,4 mg) và MA2 (10,6 mg) thu được từ phân đoạn 4C thông qua sắc ký cột sephadx LH-20, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (1:1). Tiến hành sắc ký phân đoạn 4E
qua cột pha đảo YMC PR-18 sử dụng hệ dung môi acetone:H2O (1:3) thu được các phân đoạn 5A (20mg), 5B (30 mg) và 5C (50 mg). Gộp 2 phân đoạn 5A và 5B tiến hành sắc ký bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC) với dung môi 22% acetonitrile ACN:H2O thu được hợp chất MA3 (5,0 mg) ở thời gian lưu của pic 39,7 phút.
Hình 3.1. Sơ đồ chiết, phân lập các hợp chất từ loài M. apelta
3.2. Kết quả xác định cấu trúc của các hợp chất đã phân lập được
3.2.1. Hợp chất MA1: Vitexin
Chất bột màu vàng.
Nhiệt độ nóng chảy: tnc = 273 – 275 ˚C Công thức phân tử: C21H20O10, M = 432.
Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6) của hợp chất MA1 và hợp chất tham khảo xem Bảng 3.1.
Hình 3.2. Cấu trúc và các tương tác HMBC chính của hợp chất MA1
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất MA1 và hợp chất tham khảo
C #,aδC a,bδC a,c
δH (mult, J= Hz) HMBC (H→C) 2 165.0 163.92 - 3 103.2 102.41 6.76 (s) 2,4,10,1′ 4 183.1 182.04 - 5 161.7 160.38 - 6 99.0 98.14 6.26 (s) 5,7,8,10 7 163.7 162.68 - 8 105.4 104.59 - 9 157.1 155.98 - 10 105.2 104.59 - 1′ 122.7 121.59 - 2′ 129.7 129.00 8.02 (d, 8.0) 2,4′,6′ 3′ 116.6 115.00 6.89 (d, 8.0) 1′,4′,5′ 4′ 162.2 161.3 - 5′ 116.6 115.00 6.89 (d, 8.0) 1′,2′,3′ 6′ 129.7 129.00 8.02 (d, 8.0) 2,2′,4′ 5-OH - - 13.15 (s) 5,6,10 1′′ 74.4 73.36 4.69 (d, 10.0) 7,8,9 2′′ 71.9 70.84 3.84 (t, 9.5) 8 3′′ 79.9 78.65 3.29 (m) 4′′ 71.6 70.54 3.34 (m) 5′′ 82.5 81.80 3.26 (m) 6′′ 62.4 61.28 3.51 (m) 3.76 (m)
aĐo trong DMSO-d6, b125 MHz, c500 MHz,#δC của vitexin [18].
Hợp chất MA1 thu được dưới dạng bột vô định hình màu vàng. Trên phổ 1H- NMR của hợp chất MA1 thấy có xuất hiện hai cặp tín hiệu doublet tại δH 6,89 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3′, H-5′) và 8,02 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2′, H-6′) đặc trưng cho vòng thơm thế para, tín hiệu hai proton thơm tại δH 6,76 (1H, s, H-3) và 6,26 (1H, s, H-6) cho phép dự đoán đây là một hợp chất flavonoid dạng apigenin. Ngoài ra, trên phổ này
cũng quan sát thấy tín hiệu của một proton anome tại δH 4,69 (1H, d, J =10,0 Hz, H- 1'') gợi ý trong MA1 có mặt của một gốc đường. Các proton của một cấu tử đường cũng được phát hiện trong vùng tín hiệu δH 3,26 – 4,69 ppm. Đặc biệt, giá trị hằng số tương tác J của proton gắn vào cacbon anome có giá trị cao hơn (J =10,0 Hz) so với các giá trị tương ứng trong trường hợp nối qua liên kết O-glycosid. Điều này gợi ý sự có mặt của một cấu tử đường nối C-C vào aglycon.
Trên phổ 13C-NMR của MA1 xuất hiện tín hiệu của 21 nguyên tử cacbon. Trong đó có 6 tín hiệu tại δC 73,36 (C-1′′), 70,84 (C-2′′), 78,65 (C-3′′), 70,54 (C-4′′), 81,80 (C-5′′), 61,28 (C-6′′) khẳng định sự có mặt của gốc đường glucose và tín hiệu 15 nguyên tử cacbon δC 163,92 (C-2), 102,41 (C-3), 182,04 (C-4), 160,38 (C-5), 98,14 (C-6), 162,68 (C-7), 104,59 (C-8), 155,98 (C-9), 104,59 (C-10), 121,59 (C- 1′), 129,00 (C-2′, 6′), 115,00 (C-3′, 5′), 161,3 (C-4′) thuộc vào khung flavonoid có vòng B thế para. So sánh số liệu phổ NMR của MA1 với của hợp chất vitexin [18] cho thấy sự tương đồng ở các vị trí tương ứng.
Ngoài ra, việc ghi các phổ HSQC và HMBC cũng được thực hiện để có thể gán một cách chính xác các giá trị độ dịch chuyển hóa học của các vị trí tương ứng. Tương tác HMBC của H-1''glc với C-7, C-8 và C-9 khẳng định sự có mặt của liên kết C-C và vị trí của liên kết này với C-8. Tương tác HMBC của H-6 (δH 6,26) với C-8, C-10 cũng như tương tác của H-3 (δH 6,76) với C-10, C-1' cũng đã khẳng định sự có mặt của 2 nhóm hydroxyl tại C-5 và C-7, nối đôi tại C2/C3. Thêm vào đó, tương tác HMBC rất rõ của proton 5-OH (δH 13,15) với C-5 (δC 160,38) và tương tác H-1''glc với C-9 (δC 155,98) khẳng định δC của C-9 phải là 155,98 và C-5 phải là 160,38. Từ những dữ liệu trên cho phép xác định hợp chất MA1 là vitexin.
3.2.2. Hợp chất MA2: apigenin-7-O-β-D-glucosid
Chất bột vô định hình màu vàng
Nhiệt độ nóng chảy: tnc = 218 – 220 ˚C Công thức phân tử C21H20O10, M = 432
Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất MA2
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của chất MA2 và chất tham khảo
C # δC a,bδC a,c δH (Mult, J = Hz) 2 164.2 164.3 - 3 103.0 103.0 6.84 (1H, s) 4 181.6 182.0 - 5 161.0 161.6 - 6 99.6 99.6 6.43 (1H, d, 1.5) 7 162.8 162.9 - 8 94.9 94.9 6.82 (1H, d, 1.5) 9 156.8 156.9 - 10 105.3 105.3 - 1′ 121.1 120.9 - 2′, 6′ 128.1 128.6 7.94 (1H, d, 8.5) 3′, 5′ 115.8 116.1 6.92 (1H, d, 8.5) 4′ 160.9 161.1 - 1′′ 100.3 99.9 5.06 (1H, d, 7.5) 2′′ 73.1 73.1 3.26 (1H, dd, 7.5, 9.0) 3′′ 77.0 77.2 3.45 (1H, t, 9.0) 4′′ 69.9 69.6 3.19 (1H, t, 9.0) 5′′ 76.4 76.5 3.29 (1H, m) 6′′ 60.8 60.6 3.71 (1H, d, 11.5) 3.50 (1H, dd, 6.0, 11.5)
aĐo trong DMSO-d6, b125 MHz, c500 MHz,
#
δC của apigenin-7-O-β-D-glucosid [19].
Hợp chất MA2 thu được dưới dạng bột vô định hình màu vàng. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất MA2 thấy có xuất hiện cặp tín hiệu doublet tại δH 6,43 (1H, d, J = 1,5 Hz, H- 6) và 6,82 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8) điển hình cho hai proton ở vị trí C-6 và C-
8 của vòng A và một proton thơm tại δH 6,84 (1H, s, H-3) của hợp chất flavonoid. Hai cặp tín hiệu doublet khác tại δH 6,92 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′) và 7,94 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′) đặc trưng cho vòng thơm B thế para, cho phép dự đoán đây là một hợp chất flavonoid dạng apigenin. Ngoài ra, trên phổ này cũng quan sát thấy tín hiệu của một proton anome tại δH 5,06 (1H, d, J =7,5 Hz, H-1'') gợi ý trong
MA2 có mặt của một gốc đường.
Phổ13C-NMR và HSQC của hợp chất MA2 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 21 nguyên tử cacbon. Trong đó có 6 tín hiệu tại δC 99,9 (C-1′′), 73,1 (C-2′′), 77,2 (C-3′′), 69,6 (C-4′′), 76,5 (C-5′′), 60,6 (C-6′′) khẳng định sự có mặt của gốc đường glucose và tín hiệu 15 nguyên tử cacbon δC 164,3 (C-2), 103,0 (C-3), 182,0 (C-4), 161,6 (C-5), 99,6 (C-6), 162,9 (C-7), 94,9 (C-8), 156,9 (C-9), 105,3 (C-10), 120,9 (C-1′), 128,6 (C-2′, 6′), 116,1 (C-3′, 5′), 161,1 (C-4′) thuộc vào khung flavonoid có vòng B thế para. Các dữ kiện phổ 1H, 13C-NMR của MA2 gợi ý đây là một flavonoid dạng apigenin gắn với một đường glucose. So sánh các dữ liệu phổ NMR của MA2 với hợp chất apigenin-7-O-β-D-glucosid đã được công bố từ loài S. tenuifolia [19] cho thấy sự tương đồng ở các vị trí tương ứng. Như vậy, từ dữ liệu trên có thể khẳng định hợp chất MA2 là apigenin-7-O-β-D-glucosid.
3.2.3. Hợp chất MA3: apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D- glucopyranosid
Chất bột vô định hình màu vàng Nhiệt độ nóng chảy: tnc = 297 - 298 ˚C Công thức phân tử C26H28O14, M = 564
Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng3.3
Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất MA3
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của chất MA3 và chất tham khảo
3 104.2 103.6 6.61 (1H, s) 4 184.0 184.2 - 5 163.1 164.5 - 6 101.1 101.0 6.46 (1H, d, 1.5) 7 164.8 164.8 - 8 96.2 95.8 6,77 (1H, d, 1.5) 9 159.1 158.9 - 10 107.2 107.0 - 1′ 123.1 121.9 - 2′,6′ 129.8 129.7 7.85 (2H, d, 8.5) 3′, 5′ 117.2 117.6 6.90 (2H, d, 8.5) 4′ 163.2 164.5 - Glu 1′′ 100.2 100.2 5.15 (1H, d, 8.0) 2′′ 78.9 78.7 3.71 (1H, dd, 8.0, 9.0) 3′′ 78.6 78.4 3.69 (1H, t, 9.0) 4′′ 71.5 71.3 3.45 (1H, t, 9.0) 5′′ 78.4 78.7 3.71 (1H, m) 6′′ 62.7 62.5 3.95 (1H, dd, 2.0, 12.0) 3.74 (1H, dd, 5.0, 12.0) Apio 1′′′ 111.1 110.9 5.48 (1H, d, 1.5) 2′′′ 78.3 78.1 3.99 (1H, d, 1.5) 3′′′ 80.8 80.7 - 4′′′ 75.6 75.4 4.07 (1H, d, 9.5) 3.84 (1H, d, 9.5) 5′′′ 66.0 65.9 3.58 (2H, br s)
a Đo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz,
#
δC của apigenin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1->2)- β-D- glucopyranosid [15]
Hợp chất MA3 phân lập được dưới dạng bột vô định hình, màu vàng. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất MA3 thấy có xuất hiện cặp tín hiệu doublet tại δH 6,46 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6) và 6,77 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8) đặc trưng cho hai proton ở vị trí C-6 và C-8 của vòng A và một proton thơm tại δH 6,61(1H, s, H-3) của hợp
chất flavonoid. Cặp hai tín hiệu doublet khác tại δH 6,90 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, 5′) và 7,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′) đặc trưng cho vòng thơm B thế para. Tín hiệu proton anome tại δH 5,15 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′′) và 5,48 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1′′ ′) gợi ý trong hợp chất MA3 có mặt 2 gốc đường.
Phổ13C-NMR và HSQC của hợp chất MA3 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 26 nguyên tử cacbon. Tín hiệu 15 nguyên tử cacbon tại δC 167,1 (C-2), 103,6 (C-3), 184,2 (C-4), 164,5 (C-5), 101,0 (C-6), 164,8 (C-7), 95,8 (C-8), 158,9 (C-9), 107,0 (C-10), 121,9 (C-1′), 129,7 (C-2′, 6′), 117,6 (C-3′, 5′) và 164,5 (C-4′) thuộc khung flavonoid có vòng B thế para tương tự như hợp chất MA2. Sự khác biệt duy nhất là có thêm một phân tử đường. Độ chuyển dịch hóa học tại C-2 tăng nhẹ (73,1 lên 78,7) gợi ý xuất hiện liên kết glycosid ở C-2 của đường glucose. So sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất MA3 với hợp chất apigenin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-
β-D-glucopyranosid thấy sự phù hợp hoàn toàn [15]. Như vậy, có thể khẳng định hợp chất MA3 là apigenin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid.
3.3. Thảo luận kết quả
Từ phân lớp nước thu được 3 hợp chất flavonoid dạng flavon. Các howph chất thuộc nhóm flavon, cũng như một số dẫn xuất tổng hợp của chúng, đã được chứng minh là thể hiện một số hoạt động sinh học, bao gồm chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư, chống nhiễm độc gen, chống dị ứng, bảo vệ thần kinh, bảo vệ tim mạch và kháng khuẩn.
3.3.1. Vitexin
Hợp chất MA1 (vitexin) có mặt trong nhiều loại thực vật và có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Từ phân đoạn EtOAc của lá cây Gừa, bằng kỹ thuật sắc ký kết hợp với các phương pháp phổ NMR, MS đã phân lập và xác định được hợp chất polyphenol là vitexin với độ tinh khiết cao có thể dùng làm chất đối chiếu trong định tính, định lượng. Trong đó, vitexin lần đầu tiên được báo cáo có trong lá cây Gừa. Đã sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng mô hình DPPH của phân đoạn ethyl acetat, vitexin cho thấy các mẫu thử trên có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Lá Gừa là nguồn nguyên liệu rất cótiềm năng trong sản xuất thuốc chống oxy hóa [3].
3.3.2. Apigenin-7-O-β-D-glucosid
Hợp chất này có mặt trong nhiều loài thực vật như Hương nhu Hải Châu (E. splendens), Kinh giới lá rách (S. tenuifolia), Cùm sọc (K. Striata,… và có hoạt tính chống oxy hóa [10], chống HIV tại IC50 > 100 µg/ml và EC50 = 1,8 µg/ml [26] và chống ung thư [17]. Apigenin-7-O-β-D-glucosid thể hiện hoạt động chống tăng sinh và chống oxy hóa mạnh đối với các loại oxy phản ứng (ROS) trong ống nghiệm theo cách phụ thuộc nồng độ. Nghiên cứu in vitro thể hiện hoạt động chống tăng sinh đáng kể chống lại các tế bào khối u ác tính B16F10 sau 24 và 48 giờ ủ.
Apigenin-7-O-β-D-glucosid tăng cường tổng hợp melanogenesis và hoạt động tyrosinas của các tế bào u ác tính B16F10, đặc biệt gây ra sự biệt hóa của các tế bào CD34 + đối với dòng hồng cầu và ức chế sự biệt hóa của tủy.
3.3.3. Apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid
Hợp chất apigenin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid có mặt trong nhiều loài thực vật như Crotalaria anagyroides, Kochujang,…và có hoạt tính chống oxy hóa [15] và chống Hepatitis B virus (HBV) [30].
Nhằm cung cấp những kiến thức về nguyên liệu lá cây Bùm bụp góp phần ứng dụng trong chăm sóc sức khỏe, đề tài nghiên cứu đã phân lập được 3 hợp chất trên, ta thấy đây là nguồn dược liệu rất hữu ích, vì vậy cần nghiên cứu, phát triển hơn nữa để cây Bùm bụp có thể được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận:
Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khóa luận: “Nghiên cứu phân lập các hợp chất flavonoid từ loài Bùm bụp [Mallotus apelta (Lour.) Muell. – Arg.]” đã thu được một sốkết quả như sau:
+ Bằng các kỹ thuật sắc ký đã phân lập được 3 hợp chất flavonoid từ dịch chiết methanol của cây Bùm bụp (Mallotus apelta).
+ Kết hợp với các phương pháp phổ phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR) và hai chiều (HMBC, HSQC) đã xác định được cấu trúc của 3 hợp chất lần lươṭ là vitexin (MA1), apigenin-7-O-β-D-glucosid (MA2) và apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid (MA3).
Kiến nghị:
Qua các nguồn tài liệu tham khảo trước có thể thấy loài thuộc chi Mallotus
chứa nhiều hợp chất thuốc nhóm flavonoid có hoạt tính sinh học tốt cho sức khỏe con người. Do đó, em đề nghị tiếp tục nghiên cứu phân lập thêm các hợp chất có trong Mallotus apelta, đưa thêm chất này vào kho tàng dữ liệu các hợp chất thiên nhiên và đánh giá hoạt tính của các hợp chất phân lập được.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Như, Nguyễn Tập &Trần Toàn; (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học vàKỹthuật, HàNội.
2. Võ Văn Chi; (2001), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Công nghệ,