2.4.2.1 Phƣơng pháp Kjeldah
Nguyên tắc: Sử dụng một chất kiềm mạnh hơn amoniac để đẩy NH4+ và NH3 ra thể tự do. Dùng hơi nƣớc kéo amoniac ra bình chuẩn độ rồi định lƣợng bằng dung dịch H2S04 0,1N với methyl đỏ làm chỉ thị màu.
Giới hạn phát hiện: trong khoảng từ 1 mg đến 25 mg N/L.
2.4.2.2 Phƣơng pháp điện cực amoni
Phƣơng pháp điện cực chọn lọc amoni sử dụng lớp màng kỵ nƣớc mà khí có thể thấm qua đƣợc để tách riêng dung dịch mẫu từ dung dịch amoni clorua bên trong điện cực. Dùng một bazơ mạnh nhƣ NaOH để nâng pH dung dịch lên trên 11, hỗn hợp amoni và amoniac sẽ biến đổi thành khí amoniac. Amoniac sinh ra khếch tán xuyên qua lớp màng làm thay đối giá trị pH bên trong dung dịch theo điện cực pH thủy tinh. Lƣợng clorua cố định bên trong dung dịch theo điện cực chọn lọc ion clorua thì phù hợp với điện cực tham khảo. Giá trị pH đƣợc đo bằng máy đo pH, từ đó xác định đƣợc hàm lƣợng amoniac trong mẫu.
NH4+ + OH־ → NH3 + H2O Giới hạn phát hiện: 0,05 đến 1400 mgNH3–N/L
2.4.2.3 Phƣơng pháp Indophenol Blue
Phƣơng pháp Indophenol hay còn gọi là phƣơng pháp phenat dựa vào phản ứng Berthelot: amoniac trong dung dịch kiềm sẽ phản ứng với phenol tạo ra dung dịch có màu xanh (indophenol blue), với sự có mặt của tác nhân oxi hóa mạnh hypochlorit. Phản ứng này thực hiện ở nhiệt độ phòng và có thể đun nóng ở 35°C và thêm chất xúc tác chứa kim loại nhƣ natri nitroprusside để đẩy nhanh tiến trình phản ứng. Đƣợc áp dụng phân tích mẫu nƣớc thải với độ cứng tổng cộng nhỏ hơn 400 mg/L và nồng độ nitrit nhỏ hơn 5 mg/1.
Cƣờng độ màu phụ thuộc vào nồng độ amoniac có trong dung dịch và lƣợng natri nitroprusside thêm vào để tăng cƣờng độ hiện màu của dung dịch. Nồng độ của amoni (NH3 và NH4+) sẽ đƣợc xác định bằng máy quang phổ ở bƣớc sóng 630 nm (nƣớc ngọt) hoặc 640 nm (nƣớc lợ – mặn).
Phƣơng trình phản ứng:
NH3 + NaOCI → NH2C1 + NaOH
2.4.2.4 Phƣơng pháp so màu Nessler
Trong môi trƣờng kiềm, NH4+ sẽ chuyển thành NH3 tạo phức màu vàng với thuốc thử Nessler. Cƣờng độ màu phụ thuộc vào hàm lƣợng NH3 trong mẫu phân tích. Phƣơng trình phản ứng:
NH4+ + 2[HgI4]2־ + 40H+ → Hg[HgOINH2] + 7I־ + 3H20 NH4+ + 2[HgI4]2־ + 2OH־ → Hg[HgI3NH2] + 5I ־+ 2H20
Chƣơng 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm và thời gian
- Địa điểm: bố trí thí nghiệm trong nhà lƣới khoa nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, thực hiện phân tích mẫu trong phòng phân tích thức ăn gia súc.
- Thời gian: 21.8 –25.9
3.1.2 Vật liệu thí nghiệm
- Giống cải ngọt của công ty Trang Nông.
- Phân bón NPK, phân Urê dd NH3 25% , tro,…
- Các hóa chất: phenol, dd H2SO4 98%, dd NaOH, KNO3, NH4OH,… - Các dụng cụ khác: thƣớc dây, thƣớc kẹp, cân, túi nilon.
3.2 Bố trí thí nghiệm và kĩ thuật canh tác 3.2.1 Bố trí thí nghiệm 3.2.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí trồng trong khay (dài 47 cm; rộng 35 cm; cao 10 cm), với 4 nghiệm thức và 7 lần lặp lại. Mỗi lần lặp lại tƣơng đƣơng với 1 khay (9 kg đất) gồm 12 cây (3x4 cây):
(1) Đối chứng : không sử dụng phân bón
(2) Urê: sử dụng phân Urê để bón thúc cho cải ngọt
(3) NH3 0,1%: sử dụng dung dịch NH3 0,1% để bón thúc cho cải ngọt (4) NH3 0,2%: sử dụng dung dịch NH3 0,2% để bón thúc cho cải ngọt
3.2.2 Kỹ thuật canh tác
3.2.2.1 Chuẩn bị đất và hạt giống
- Đất đƣợc lấy ở vƣờn cây ăn quả và đƣợc dọn sach cỏ dại, bầm đất nhỏ ra phơi đất khoảng 15 ngày. Sau đó bầm nhuyễn lần nữa để đảm bảo độ tơi xốp.
- Hạt giống: đƣợc gieo sạ với lƣợng hạt 5 kg/ha. Hạt giống ngâm trong nƣớc sau 3–4 giờ vớt ra để ráo nƣớc sau đó ủ ấm 1 đêm rồi đem gieo hạt sẽ nảy mầm nhanh và đều hơn gieo hạt khô.
3.2.2.2 Chăm sóc, bón phân
- Tƣới đẩm khay đất trƣớc khi gieo, sau khi gieo rãi lớp tro trấu mỏng phủ hạt và rắc thuốc trừ kiến, các sâu hại khác…
- Trƣớc khi gieo che lƣới phía trên cách mặt đất 2,2 m.
- Tỉa cây: khoảng 6–7 ngày tiến hành tỉa cây con chừa khoảng cách 10x15 cm (4x4).
- Trên mặt khay đất phủ lớp tro mỏng để hạn chế đất cát bắn lên lá và hạn chế sâu bênh có hại.
- Bón phân:
+ Bónlót: Bón 20 kgNPK/1000m2. + Bón thúc:
Bảng 3.1 Loại, liều lƣợng phân bón và thời gian tƣới thúc sau khi gieo cải ngọt Nghiệm thức
Liều lƣợng
9 NSKG 20 SKG
Đối chứng X X
Urê 0,05 g/khay 0,1 g/khay
NH3 0,1% 25 mL/khay 50 mL/khay
NH3 0,2% 25 mL/khay 50 mL/khay
- Phòng trừ sâu bệnh hại chính trên cải ngọt: theo dõi thƣờng xuyên phát hiện và xử lý kịp thời, chủ yếu bắt bằng tay hoặc dùng các loại thuốc vi sinh thế hệ mới.
Hình 3.2 Bón phân giai đoạn 2
3.2.2.3 Các chỉ tiêu theo dõi a. Chỉ tiêu về sinh trƣởng
- Quan sát cố định 12 cây/khay, 10 ngày lấy chỉ tiêu 1 lần.
- Chiều cao cây: dùng thƣớc cây đo từ cổ rễ đến chóp lá cao nhất của cây. - Số lá: đếm tổng số lá trên thân tính lá thật đầu tiên đến lá ngọn (có chiều dài phiến lá trên 2 cm).
- Kích thƣớc lá: dùng thƣớc cây đo chiều dài và chiều rộng của lá to nhất trên cây thu hoạch.
- Đƣờng kính gốc thân: dùng thƣớc kẹp đo gốc thân nơi cổ rễ.
b. Chỉ tiêu về thành phần năng suất và năng suất
- Khối lƣợng cây (g/cây): cân khối lƣợng tổng tất cả các cây trong khay sau đó đếm tất cả cây trong khay và cân trọng lƣợng 12 cây mẫu từ đó tính khối lƣợng trung bình cây.
- Năng suất (kg/khay): cân tất cả khối lƣợng cải ngọt trong các khay sau đó tính trung bình cho từng nghiệm thức.
Hình 3.4 Thu hoạch cải ngọt
3.2.2.4 Lấy mẫu a. Mẫu đất
Mẫu đất đƣợc lấy phân tích trƣớc khi bố trí thí nghiệm.
b. Mẫu cải ngọt
Thu tổng số cải ngọt của từng nghiệm thức đem cân tính trọng lƣợng. Lấy 4 khay đại diện của từng nghiệm thức để phân tích vật chất khô, protein thô và hàm lƣợng nitrat.
Hình 3.5 Các khay cải ngọt đại diện để phân tích chất lƣợng
3.3 Các chỉ tiêu cần phân tích
Đối với mẫu đất trƣớc khi gieo đƣợc gửi phân tích ở bộ môn Khoa học Đất để xác định các chỉ tiêu: NH4+, NO3־, P dễ tiêu, Kali.
Đối với mẫu rau: - Vật chất khô (DM) - Nitrat
3.4 Phƣơng pháp phân tích 3.4.1 Amoni NH4+ trong đất 3.4.1.1 Nguyên tắc
Việc xác định amoni dựa trên phản ứng Berthelot, theo phản ứng này dẫn xuất của phenol (ở đây là salicylat) khi có amoniac và hypoclorit sẽ tạo ra indophenol dƣới tác dụng xúc tác của natri nitroferricyanua (nitroprussid). Trong môi trƣờng kiềm, indophenol đƣợc tạo ra có màu xanh lục–lam, đo độ hấp thụ của màu này ở bƣớc sóng 660 nm.
3.4.1.2 Các hóa chất cần dùng
- KCl 2M: Hòa tan 150 g KCl trong 1 lít nƣớc cất.
- Dung dịch A: Hòa tan 4 loại hóa chất sau bằng nƣớc cất vào bình định mức 100 mL. Định mức tới vạch.
0,05 g natri nitroprusside (Na2[Fe(CN)5NO].2H2O) 13 g natri salicylate (C7H5NaO3)
10 g natri tatrate (C4H4Na2O6)
- Dung dịch B: Hòa tan 6 g NaOH trong 100 mL nƣớc cất và thêm 2 mL natri hypochloride.
3.4.1.3 Quy trình phân tích
- Xây dựng dãy chuẩn có nồng độ từ 0; 0,05; 0,1; 0,3; 0,5; 0,8; 1 mg/l từ dung dịch chuẩn NH4+ 0,1 ppm.
- Cân 2 g đất khô trong không khí và qua rây 2 mm, sau đó cho vào 20 mL KCl 2M. Lắc mẫu trong 1 giờ.
- Ly tâm và lọc lấy dung dịch trích. Hút 2 mL mẫu cho vào ống nghiệm. Thêm 2 mL dung dịch A và thêm 0,5 mL dung dịch B. Đậy nắp, lắc đều. Đem đo quang phổ UV–Vis ở bƣớc sóng 650 nm.
3.4.2 Nitrate trong đất 3.4.2.1 Nguyên tắc
Khi nitrat bị khử thành nitrit bởi vanadi (III) clorua. Sau đó, cho α–naphtyl etylendiamin dihydroclorua và sunfanilamit, sao cho tạo ra hợp chất
diazo màu đỏ trong môi trƣờng axit. Đo độ hấp thụ của nó ở bƣớc sóng 543 nm.
3.4.2.2 Hóa chất cần dùng
Dung dịch C: Cho 200 mL HCl 0,5M vào chai và cho 0,5 g vanadi (III) chlorua vào. Lắc nhẹ cho dung dịch hòa tan, nếu không tan thì đem lọc. Thêm
0,2 g sulfanilamit và 0,01 g N–(1–naphthyl) ethylendiamine dihydro chlorua vào.
3.4.2.3 Quy trình phân tích
- Xây dựng dãy chuẩn có nồng độ từ 0; 0,05; 0,1; 0,3; 0,5; 0,8; 1 ppm từ dung dịch chuẩn NO3־ 0,1 ppm.
- Cân 2 g đất khô trong không khí và qua rây 2 mm, sau đó cho vào 20 mL KCl 2M. Lắc mẫu trong 1 giờ.
- Ly tâm và lọc lấy dung dịch trích. Hút 2 mL mẫu cho vào ống nghiệm. Thêm 2 mL dung dịch C. Đậy nắp, lắc đều. Đem đo quang phổ UV–Vis ở bƣớc sóng 540 nm.
3.4.3 Lân dễ tiêu 3.4.3.1 Nguyên lý
Phƣơng pháp sử dụng chất trích NaHCO3 ở pH 8,5 với tỉ lệ trọng lƣợng đất: thể tích dung môi trích là 1:20. Phƣơng pháp đƣợc sử dụng để trích lân trên các loại đất nhƣ: đất có vôi, đất kiềm hoặc đất trung tính. Do chất trích này có pH cao, một phần lân hữu cơ trong đất cũng bị hòa tan.
Ở những loại đất có chứa nhiều canxi, đất kiềm và đất trung tính có chứa nhiều Ca3(PO4)2. Dung dịch trích này đã đƣợc chọn để kiểm soát sự hoạt động của ion Ca2+, thông qua sản phẩm hòa tan của CaCO3 trong quá trình trích trên những loại đất có chứa nhiều Ca2+. Khi hoạt tính của CO32־ trong đất gia tăng bởi dung dịch trích này thì hoạt tính của Ca2+
bị giảm, vì vậy có thể kết luận rằng khi hoạt tính của Ca2+ giảm thì hoạt tính của PO43־ gia tăng.
2HCO3־ + Ca2+ → CaCO3 + H2O + CO2 (Phản ứng 1) Ca3(PO4)2 → 3Ca2+ + 2PO43־ (Phản ứng 2)
3.4.3.2 Hóa chất cần sử dụng
NaHCO3 0,5M ở pH 8,5: Hòa tan 42 g NaHCO3 trong 1 L nƣớc cất và điều chỉnh về pH 8,5 bằng NaOH.
Amoni molybdate: Hòa tan 20 g (NH4)6Mo7O24.24H2O vào bình định mức 500 mL và định mức tới vạch, trữ dung dịch trong bình tối.
Ascorbic axit 0,1M: Hòa tan 0,89 g ascorbic axit trong 50 mL nƣớc cất. Kali antimonyl tartrate: Hòa tan 0,27 g của KSbOC4H4O5 trong 100 mL nƣớc cất.
H2SO4 2,5M: Pha loãng 70 mL H2SO4 đậm đặc (d=1,84 g/cm3) trong 400 mL nƣớc cất và định mức vào bình định mức 500 mL.
Dung dịch thuốc thử: trộn 50 mL của H2SO4 2,5M + 15 mL amoni molybdate + 30 mL ascorbic axit + 5 mL kali antimonyl tartrate, trộn đều.
Dung dịch chuẩn (50 mg/l): Hòa tan 0,219 g KH2PO4 trong bình định mức 1 lít và định mức tới vạch bằng nƣớc cất.
4–Nitrophenol 0,1%: Hòa tan 1 g trong 1 L nƣớc cất.
3.4.3.3 Quy trình phân tích
- Xây dựng đƣờng chuẩn 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 ppm từ dung dịch chuẩn 50 ppm.
- Cân 1,5 g đất vào ống ly tâm, cho vào 30 mL dung dịch NaHCO3 0,5M và lắc 30 phút, mẫu blank cũng chuẩn bị tƣơng tự, sau đó ly tâm và lọc qua giấy lọc.
- Hút 5 mL dung dịch lọc đƣợc cho vào bình định mức 50 mL. Thêm 2–3 giọt chỉ thị màu 4–nitrophenol và điều chỉnh môi trƣờng về khoảng pH=5 bằng dung dịch H2SO4 2,5M. Lắc mẫu và để một lúc cho thoát khí CO2.
- Sau đó thêm vào 8 mL dung dịch thuốc thử và định mức tới vạch bằng nƣớc cất. Sau 15 phút, đo mẫu ở bƣớc sóng 880 nm.
- Làm tƣơng tự với mẫu blank.
3.4.4 Kali trong đất 3.4.4.1 Nguyên lý
Xác định hàm lƣợng kali tổng số đƣợc thực hiện trên máy phổ hấp thu nguyên tử, mẫu đƣợc phun vào ngọn lửa của hỗn hợp không khí–acetylene tại đây nó sẽ hóa hơi. Ngọn lửa cắt đứt các liên kết phân tử tạo thành nguyên tử kali tự do, chúng hấp thu ánh sáng đơn sắc đặc trƣng phát xạ từ bóng đèn của nguyên tố kali (catot rỗng). Bƣớc sóng đặc trƣng cho kali là 766 nm.
3.4.4.2 Hóa chất cần sử dụng
Hỗn hợp phá mẫu: 18 mL nƣớc cất vào bình tam giác 250 mL, thêm từ từ 100 mL H2SO4 đậm đặc, sau đó thêm 6 g axit salicylic, khuấy đều.
Dung dịch cesi clorua 1%: Hòa tan 10 g cesi trong một ít nƣớc cất cho vào bình định mức 1 L, thêm tiếp 83 mL HCl (12 mol/l) sau đó dùng nƣớc cất định mức tới vạch.
Dung dịch chuẩn kali nồng độ 1000 ppm
Dung dịch chuẩn kali nồng độ 20 ppm: Hút 2 mL dung dịch kali chuẩn 1000 ppm cho vào bình định mức 100 mL. Định mức tới vạch.
3.4.4.3 Quy trình phân tích
- Vô cơ hóa mẫu: Cân 0,3 g mẫu vào bình tam giác thêm 3,3 mL hỗn hợp o
5 giọt H2O2 30% và tiếp tục đun nóng đến khi mẫu trắng hoàn toàn. Sau đó để nguội chuyển mẫu vao bình định mức 50 mL và định mức tới vạch. Lọc mẫu lấy dịch chiết.
- Xây dựng đƣờng chuẩn có nồng độ từ 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 ppm.
- Hút 1 mL dung dịch mẫu (dịch trích) cho vào ống chứa mẫu 20 mL. Thêm 1 mL dung dịch CsCl 1% lắc đều mẫu. Thêm 8 mL nƣớc cất, lắc đều.
- Đo mẫu trên máy hấp thu nguyên tử có bƣớc sóng 766 nm. - Thực hiện tƣơng tự với mẫu blank và đƣờng chuẩn.
3.4.5 Vật chất khô trong rau (DM) 3.4.5.1 Nguyên lý 3.4.5.1 Nguyên lý
Dùng sức nóng để làm bay hết hơi nƣớc trong mẫu. Cân trọng lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy khô, từ đó tính ra % nƣớc có trong mẫu.
Ta có: %DM = 100 – độ ẩm
Do đó ta cần xác định độ ẩm có trong mẫu rau.
3.4.5.2 Quy trình phân tích
Tiến hành cân và ghi nhận một khối lƣợng mẫu chính xác, sau đó sấy ở 105oC. Sau khi sấy đƣợc 3 giờ, mẫu đƣợc lấy ra và làm nguội trong bình hút ẩm, mẫu đƣợc cân sau khi đã nguội, tiếp tục lặp lại quá trình này sau mỗi 30 phút đến khi khối lƣợng mẫu cân đƣợc không thay đổi.
3.4.5.3 Tính toán kết quả:
Độ ẩm quy về phần trăm (X) đƣợc tính theo công thức:
100 2 1 2 m m m X (%) Trong đó:
o m1: Khối lƣợng mẫu sau khi sấy đến khối lƣợng không đổi (g).
o m2: Khối lƣợng mẫu trƣớc khi sấy (g).
Tiến hành 3 lần lặp lại với mỗi mẫu phân tích. Kết quả độ ẩm đƣợc tính trung bình của 3 lần lặp lại đó.
3.4.6 Xác định nitơ tổng số bằng phƣơng pháp Kjeldahl (theo Bremner) Bremner)
Nguyên lý: Phƣơng pháp Kjeldahl dựa trên nguyên lý chuyển toàn bộ nitơ trong hợp chất hữu cơ thành muối amoni bằng cách công phá với H2SO4 (có K2SO4 tăng nhiệt độ sôi; CuSO4 và Se xúc tác). Xác định hàm lƣợng NH4+ bằng dụng cụ Kjeldahl khi cho muối amoni tác dụng với kiềm. Thu NH3 bằng
dung dịch axit boric và chuẩn độ amoni borat bằng dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N.
H3BO3 + NH3 → NH4H2BO3 H2BO3– + H+ → H3BO3
Axit boric là một axit rất yếu (Ka =5,8.10–10) với dung dịch H3BO3 0,65M có độ pH =4,7 và khi trung hòa hết 20% H+
ở nấc điện ly thứ nhất bằng NH3 thì pH đã tăng lên 8,6. Khi chuẩn độ bằng một axit mạnh, loãng tại điểm đổi màu pH =4,5 cho phép kết thúc định phân.
3.4.6.1 Phƣơng pháp công phá mẫu
Mẫu đƣợc công phá bằng H2SO4 với hỗn hợp xúc tác để chuyển toàn bộ nitơ hữu cơ thành dạng N–NH4+.
3.4.6.2 Quá trình công phá
- Cân 100 mg mẫu (đã nghiền nhỏ và trộn kỹ).
- Thêm 0,5 g hỗn hợp xúc tác và 7 mL H2SO4 đậm đặc (d =1,84). - Lắc đều và để yên cho nguyên liệu thấm đều với axit.
- Đặt lên bếp điện khoảng 20 phút ở nhiệt độ thấp (< 300oC).
- Sau đó tăng nhiệt độ lên 360oC để dung dịch sôi trong 1 giờ (khi toàn bộ dung dịch trong suốt là đƣợc).