Các chủng khác cho kết quả thử nghiệm là không có vòng kháng sau khi xử lý proteinase K nhưng lại có vòng kháng sau khi xử lý enzyme tripsin. Do đó, chưa thể xác định được dịch kháng khuẩn có phải là dịch bacteriocin thô hay không.
3.4 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn
Nuôi cấy chủng được tuyển chọn trên môi trường thạch TSA quan sát hình thái khuẩn lạc của chủng tuyển chọn N14 để phục vụ cho việc định danh sau này. Kết quả thể hiện như sau :
- Hình thái khuẩn lạc : Khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa, trơn, hơi lồi lên trên bề mặt thạch, bờ đều.
- Hình thái tế bào : Vi khuẩn Gram (+), trực khuẩn ngắn. B1.1
N14
Proteinase K
Trypsin
Hình 3.4 : Hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn N14
A : khuẩn lạc trên đĩa cấy ria ; B : hình thái khuẩn lạc phóng to
C : hình thái tế bào khuẩn lạc ; D : cấy điểm
Kết luận chủng N14 là vi khuẩn gram dương là vi tế bào của nó bắt màu tím của thuốc nhuộm tím violet. Điều này được giải thích như sau, do vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày, dạng lưới, cấu tạo bởi peptidoglycan, có khả năng giữ phức hợp tím kết tinh – liugol khi nhuộm. Khi tẩy cồn, có lỗ petidoglycan co lại, khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp này bên trong tế bào. Do đó tế bào không bắt màu nhuộm fuchsin bổ sung, kết quả là tế bào vi khuẩn vẫn có màu tím.
3.5 Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn 3.5.1 Khả năng chịu muối
Chủng chọn lọc được nuôi trong môi trường TSB ở các nồng độ muối khác nhau từ 1% - 12% ở 370C, để kiểm tra khả năng chịu muối của các chủng. Kết quả sau 24 giờ nuôi được thể hiện ở bảng sau :
Bảng 3.4: Khả năng chịu muối của N14
Nồng độNaCl(%)
Chủng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
N14 + + + + + + + - - - - -
Từ bảng 3.4, cho thấy chủng N14 là chủng chịu mặn, có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt ở môi trường có nồng độ muối thấp. Do đó chủng có khả năng sinh sống ở các vùng gần bờ, ở các vùng vịnh và cửa sông, nhu cầu về Na+ là cần thiết đối với chủng này.
Sau 24 giờ, qua hình 3.5 ta thấy khuẩn lạc mọc dày đều trên các đường ria ở các nồng độ từ 1-3% ở cả 2 chủng. Chủng phát triển mạnh nhất ở nồng độ 2%, có thể kết luận rằng chủng N14 sống tốt ở vùng biển có độ mặn không cao. Ở nồng độ muối 6%, khuẩn lạc bắt đầu thưa dần, đến nồng độ 7% vẫn có khả năng phát triển nhưng rất yếu. Vậy nồng độ 7% chính là giới hạn trên của khả năng chịu muối . Từ nồng độ 8% trở đi vi khuẩn không thể phát triển được nữa do nồng độ quá cao.
Qua đây có kết luận rằng, chủng N14 có khoảng giới hạn khả năng chịu muối là khá cao từ 1% - 7%, môi trường nuôi cấy thích hợp nhất là bổ sung muối có nồng độ 1 - 2%.
Hình 3.5 : Khả năng chịu muối của chủng N14
3.5.2 Thử catalase
Nuôi cấy dịch vi khuẩn sau 24 giờ, tiến hành nhỏ một giọt H2O2 30% vào dịch vi khuẩn, kết quả cho thấy dương tính đối với khả năng sinh enzyme catalase. Enzyme này là enzyme chỉ hiện diện ở vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy tiện có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp hiếu khí. Sự thủy phân hydrogen peroxide sẽ giải phóng O2 gây ra hiện tượng sủi bọt.
2H2O2 2HCatalase 2O + O2 10% 1% 2% 3% 4% 7% 6% 11% 12% 9% 8% 5%
Hình 3.6 : Khả năng sinh catalase của N14
3.5.3 Tính di động
Để kiểm tra khả năng này, ta cấy thẳng chủng vi khuẩn vào môi trường thạch TSA. Nuôi cấy sau 24 giờ, kết quả cho thấy cả chủng vi khuẩn chỉ mọc theo đường cấy, chứng tỏ rằng chúng không có khả năng di động. Qua hình 3.7, ta còn thấy rằng chủng N14có khả năng sinh hơi làm nứt thạch, và đẩy thạch lên trên.
Hình 3.7 : Khả năng di động của chủng N14 N14
N14 ĐC
3.5.4 Khả năng sinh hơi
Khi vi khuẩn sử dụng nguồn carbon để lên men, tùy phương thức lên men sẽ tạo ra được các sản phẩm khác nhau bao gồm rượu, các acid hữu cơ, CO2... Qua quá trình thử nghiệm khả năng này, cho kết quả dương tính, song khả năng sinh hơi là rất yếu, chỉ xuất hiện bóng khí trong ống Durham nhưng không thể đẩy ống nổi lên trên môi trường. Vậy có thể kết luận rằng sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men ở chủng N14 có CO2.
Hình 3.8 : Khả năng sinh hơi của chủng N14
3.6 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
Kết quả giải trình tự DNA của chủng N14 thu được đoạn gen có kích thước là 835bp. Trình tự sau khi được phân tích, chỉnh sửa bằng phần mềm BioEdit 7.1.3.0 và Genious Pro 5.5.7, và được so sánh với các trình tự nucleotide tương đồng trên Genbank bằng chương trình BLAST (www. ncbi . nlm . nih . gov / blast /). Kết quả cho thấy chủng N14 có độ tương đồng cao nhất với chủng Proteus sp. là 99%.
Như vậy, có thể kết luận sơ bộ chủng vi khuẩn N14 phân lập được, có khả năng sinh bacteriocin thuộc chủng Proteus sp.
Chương IV : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 4.1 Kết luận
Từ những kết quả nghiên cứu ở trên chúng em đã đưa ra một số kết luận như sau :
1) Đã phân lập được 46 chủng trong đó có 20 chủng có hoạt tính kháng khuẩn.
2) Từ các chủng đã phân lập trên tuyển chọn được chủng N14 sinh bacteriocin.
3) Xác định được sơ bộ các đặc điểm của chủng N14 : - Có khuẩn lạc tròn màu trắng sữa, trơn,bờ đều
- Khả năng chịu muối ở nồng độ 1 - 7%, có khả năng sống ở những nơi có độ mặn không quá cao.
- Sinh hơi, hay sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men nguồn carbon có chứa CO2
- Không có khả năng di động - Sinh enzyme catalase.
4) Chủng được xác định là chủng Proteus sp.N14 có kích thước gen là 835bp.
4.2 Kiến nghị
1) Nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm sinh hóa của chủng N14.
2) Xác định điều kiện nuối cấy tối ưu để chủng N14 phát triển và sinh trưởng tối ưu nhất.
3) Kiểm tra lại các chủng còn lại trong số các chủng đem thử nghiệm enzyme để đưa ra kết luận chính xác hơn, làm phong phú thêm bộ sưu tập chủng vi khuẩn sinh bacteriocin.
4) Tiến hành phân loại bacteriocin.
5) Nghiên cứu khả năng ứng dụng của bacteriocin trong các lĩnh vực khác nhau như y học, công nghiệp thực phẩm…
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Thị Hồng Tuyết (2004). “Nghiên cứu bcateriocin sản xuất bởi Lactobacillus acidophilus NrrlB – 2092”. Luận văn thạc sĩ Sinh học, ĐHQG TpHCM.
2. Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Thị Yến Ly, Huỳnh Xuân Phong, Đại học Cần Thơ. “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn”. Tạp chí Khoa học 2011 : số 19a 176-184.
3. Nguyễn Đức Hùng, Lê Đình Hùng, Huỳnh Lê Tâm (2004). “Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản”. Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội.
4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty(2005). “Vi sinh vật học”.Nhà xuất bản giáo dục.
5. Nguyễn Thị Đà, Hoa Thị Minh Tú, Lê Thanh Bình (2008). “Một số tính chất của bcteriocin được tổng hợp bởi vi khuẩn lactic phân lập từ sữa bò tươi”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 46, số 6, 2008, Tr. 33-34. 6. Nguyễn Thị Bích Thủy (2004). “Một số dẫn liệu về ảnh hưởng của các
điều kiện môi trường lên sự sinh trưởng của tôm con (juvenile) tôm hùm bông (Panulirus ornatus) ở vùng biển miền trung Việt Nam”. Tuyển tập các công trình nghiên cứu khao học công nghệ (1984 – 2004), trung tâm nghiên cứu thủy sản III – nha trang. Tr 73 - 81
7. Nguyễn Thị Bích Thủy(2006). “Kỹ thuật nuôi tôm hùm. GT kỹ thuật nuôi giáp xác”. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh.
8. Trần Linh Thước (2006). “Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm”. Nhà xuất bản giáo dục, Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
9. Axelsson L, Holck A (1995). “The genes involved in production of and immunity to sakacin A, a bacteriocin from Lactobacillus sake Lb706”. J.Bacteriol 177 (8): 2125-37.
10. Broadbent JR, Chou YC, Gillies K, Kondo JK (1989). “Ninsin inhitbits several gram – positive, mastitis–causing pathogens”. J.Dairy Sci, 1989, Dec;72(12) :3342-5.
11. Brötz H and Sahl H-G (2000). “New insights into the mechanism of action of lantibiotics—diverse biological effects by binding to the same molecular target”. Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2000) 46, 1-6. 46 (1): 1–6. DOI:10.1093/jac/46.1.1. PMID 10882681
12. Desriac F, Defer D, Bourgougnon N, Brillet B, Le Chevalier P, Fleury
Y (2010). “Bacteriocin as Weapons in the Marine Animal-Associated Bacteria Warfare: Inventory and Potential Applications as an Aquaculture Probiotic”. Marine Drugs 2010 , 8 , 1153-1177, DOI 10.3390/md8041153.
13.Gert N.Moll, Wil N.Konings, Arnold J.M.Driessen (1999). “Bacteriocin: mechanism of membrane insertion and pore formation”. Antonie van Leeuwenhoek, 76, 185 – 198.
14.H.chen, D.G.Hoover (2003). “Bacteriocin and their food applications”. Comprehensive review in food sience and food safety. 2, 82 – 85.
15.Hühne K, Axelsson L, Holck A, Kröckel L (1996). “Analysis of the sakacin P gene cluster from Lactobacillus sake Lb674 and its expression in sakacin-negative Lb. sake strains". Microbiology (Reading, Engl.) 142(6): 1437–48. PMID 8704983 .
16. Jack RW, Tagg JR, Ray B (1995). “bacteriocin of gram-positive bacteria”. Microbiol Rev 59:171-200
17.Joerger MC, Klaenhammer TR (1986). “Characterization and purification of helveticin J and evidence for a chromosomally determined bacteriocin produced by Lactobacillus helveticus 481”. J.Bacteriol, 1986 Aug167(2):439-46.
18.Jofré A, Garriga M, Aymerich T (2007). “Inhibition of Listeria monocytogenes in cooked ham through active packaging with natural
antimicrobials and high-pressure processing”. J. Food Prot, 70 (11): 2498- 502, PMID 18044426.
19.Jose´ L Balcázar, Sara Loureiro, Yolanda J Da Silva, José Pintado and Miquel Planas (2010). “Identification and characterization of bacteria with antibacterial activities isolated from seahorses (Hippocampus guttulatus)”. The Journal of Antibiotics (2010) 63, 271– 274, DOI:10.1038/ja.2010.27, published online 26 March 2010.
20.Juan C. Oscáriz, Antonio G. Pisabarro (2001). “Classification and mode of action of membrane-active bacteriocin produced by gram positive bacteria”. Int. Microbiol (2001) 4: 13-19, DOI 10.1007/s101230100003, published online 25 August 2001.
21.Katla T, Møretrø T, Sveen I, Aasen IM, Axelsson L, Rørvik LM, Naterstad K (2002). “Inhibition of Listeria monocytogenes in chicken cold cuts by addition of sakacin P and sakacin P-producing Lactobacillus sakei”. J.Appl. Microbiol 93 (2): 191-196, DOI : 10.1046/j.1365- 2672.2002.01675.x PMID 12147066
22.M.A. Riley, M.A. Chavan (Eds.). “Bacteriocins ecology and evolution” 23. Poeta P, Costa D, Sáenz Y, Klibi N, Ruiz-Larrea F, Rodrigues J,
Torres C (2005). “Characterization of antibiotic resistance genes and virulence factors in faecal enterococci of wild animals in Portugal”. J.Vet Med B Infect Dis Vet Public Health, 2005, Nov;52(9):396-402.
24.Vesterlund S, Paltta J, Lauková A, Karp M, Ouwehand AC (2004).
“Rapid screening method for the detection of antimicrobial substances”. J.Microbiol Methods, 2004 , Apr;57(1):23-31.
PHỤ LỤC Phụ lục 1 : Thành phần các hỗn hợp a. Môi trường TSB Trypticase peptone 17g Phytone peptone 3g NaCl 5g K2HPO4 2,5g Glucose 2,5g Nước cất 1000ml
b. Thuốc nhuộm tím violet
Tím violet 1g
Rượu 1g
Phenol tinh thể 2g
Nước cất 100ml
c. Thuốc nhuộm liugol
Iod tinh thể 1g
KI 2g
Nước cất 200ml
d. Thuốc nhuộm Fuschin
Fuschin kiềm 1g
Rượu ethylic 95% 10ml
Phenol tinh thể 5g
Phụ lục 2 : Giải trình tự
Hình trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng Proteus sp. N14 (835 bp) 1 ACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAA GCCTGATGCA 50 51 GCCATGCCGC GTGTATGAAG AAGGCCTTAG GGTTGTAAAG TACTTTCAGC 100 101 GGGGAGGAAG GTGTTAAGAT TAATACTCTT ATCAATTGAC GTTACCCGCA 150 151 GAAGAAGCAC CGGCTAACTC CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGGAGGGT 200 201 GCAAGCGTTA ATCGGAATTA CTGGGCGTAA AGCGCACGCA GGCGGTCAAT 250 251 TAAGTCAGAT GTGAAAGCCC CGAGCTTAAC TTGGGAATTG CATCTGAAAC 300 301 TGGTTGGCTA GAGTCTTGTA GAGGGGGGTA GAATTCCACG TGTAGCGGTG 350 351 AAATGCGTAG AGATGTGGAG GAATACCGGT GGCGAAGGCG GCCCCCTGGA 400
401 CAAAGACTGA CGCTCAGGTG CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC
451 ACCCTGGTAG TCCACGCTGT AAACGATGTC GATTTAGAGG TTGTGGTCTT 500 501 GAACCGTGGC TTCTGGAGCT AACGCGTTAA ATCGACCGCC TGGGGAGTAC 550 551 GGCCGCAAGG TTAAAACTCA AATGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT 600 601 GGAGCATGTG GTTTAATTCG ATGCAACGCG AAGAACCTTA CCTACTCTTG 650 651 ACATCCAGCG AATCCTTTAG AGATAGAGGA GTGCCTTCGG GAACGCTGAG 700 701 ACAGGTGCTG CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GTTGTGAAAT GTTGGGTTAA 750 751 GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTATCCTTT GTTGCCAGCG CGTGATGGCG 800 801 GGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAG 835
Bảng so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng Proteus sp.N14 với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST
Accession Description Max
score Total score Query coverage E value Max ident Links
NR_043998.1 Proteus penneri strain
NCTC 12737 16S ribosomal RNA, partial sequence
1498 1498 100% 0.0 99%
NR_043997.1 Proteus mirabilis strain
NCTC 11938 16S ribosomal RNA, partial sequence
1487 1487 100% 0.0 99%
NR_025336.1 Proteus vulgaris strain
DSM 30118 16S ribosomal RNA, partial sequence
1476 1476 100% 0.0 99%
NR_043999.1 Proteus myxofaciens strain
NCIMB 13273 16S ribosomal RNA, partial sequence