2.1. Đối tượng nghiờn cứu
Chỳng tụi tiến hành nghiờn cứu trờn giống đậu tương ĐT22 là giống đậu tương mới cho năng suất cao do Trung tõm Nghiờn cứu và thực nghiệm đậu đỗ, Viện Khoa học kĩ thuật Nụng nghiệp Việt Nam cung cấp, giống ĐT22 được chọn tạo từ dũng đột biến hạt lai của tổ hợp DT95 và ĐT12, cú năng suất cao từ 15 - 27 tạ/ha, thời gian sinh trưởng ngắn (85 - 90 ngày). Số quả chắc trung bỡnh: 25 - 40 quả, tỉ lệ quả cú 3 hạt cao (16 - 25%), khối lượng 1000 hạt (140 - 150g) cú thể trồng 3 vụ trong năm.
2.2. Phương phỏp nghiờn cứu
2.2.1. Thời gian và địa điểm
- Thời gian nghiờn cứu từ thỏng 3/2008 - 6/2009.
- Địa điểm nghiờn cứu được tiến hành tại khu nhà lưới thớ nghiệm thuộc khoa sinh - KTNN và Trung tõm Hỗ trợ nghiờn cứu khoa học và chuyển giao cụng nghệ Trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.2.2. Bố trớ thớ nghiệm
Hạt được gieo trong chậu thớ nghiệm, chia cỏc chậu thành cỏc lụ đối chứng và thớ nghiệm, được tiến hành ở 4 giai đoạn (cõy non, ra hoa, quả non, quả chắc) mỗi lụ thớ nghiệm được nhắc lại 8 lần với tổng số chậu là 136 chậu, kớch thước mỗi chậu 35 x 45cm, mỗi chậu gieo 6 hạt. Thớ nghiệm được trồng trong khu nhà lưới thuộc khoa Sinh – KTNN của trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
Cõy được đảm bảo chế độ chăm súc thụng thường đến ngày thứ 14, 15 sau khi gieo [3], [12], gõy hộo lụ thớ nghiệm bằng cỏch khụng tưới nước và cỏch li với nước cho đến khi lỏ dưới cựng của cõy cú triệu chứng hộo, lụ đối chứng tưới nước bỡnh thường. Tiến hành đo huỳnh quang diệp lục và hàm
lượng prolin từ ngày ngừng tưới nước đến khi lỏ dưới cựng bị hộo và tiếp tục đo cỏc mẫu khi tưới nước trở lại (giai đoạn phục hồi).
Giai đoạn ra hoa (ngày thứ 28, 30 sau khi gieo), giai đoạn quả non (sau khi hoa nở rộ khoảng 7 ngày), quả chắc (khi đó cú hạt đầy đủ, khoảng 21-25 ngày sau khi quả hỡnh thành) tiến hành gõy hạn và xỏc định cỏc chỉ tiờu như giai đoạn cõy non.
Khi quả chớn, thu hoạch để lấy số liệu xỏc định cỏc chỉ tiờu cấu thành năng suất, và hàm lượng nitơ tổng số.
2.2.3. Phương phỏp phõn tớch cỏc chỉ tiờu
* Xỏc định huỳnh quang diệp lục
Huỳnh quang diệp lục được đo trờn mỏy Chlorophyll Fluorometer OS 30-ADC (Anh). Hệ thống gồm thõn mỏy cú màn hỡnh hiển thị dữ liệu gắn với đầu đo gọn nhẹ, dễ tiến hành tại thực địa và hệ thống kẹp phõn tớch adaption clip cho phộp đo nhiều mẫu cựng một lỳc. Ánh sỏng của mỏy được cung cấp bằng đốn halogel 35W, ỏnh sỏng điều biến. Mỏy sử dụng đầu dũ PIN photodiode với kớnh lọc 700 - 750W. Dựng adaption clip kẹp nhẹ vào mẫu đo trước 7 phỳt, sau đú dựng đầu đo khớp với adaption clip, ấn nỳt đo Mode trờn thõn mỏy hoặc trờn đầu đo, cỏc tham số Fo, Fm, Fvm hiển thị trờn màn hỡnh thõn mỏy và lưu trữ trong card ghi dữ liệu.
* Xỏc định hàm lượng prolin
Hàm lượng prolin được xỏc định theo phương phỏp của Bates (1973) và cải tiến của Đinh Thị Phũng 2001 [23]. Cõn 0,5 g/mẫu nghiền kĩ, thờm 10 ml dung dịch axit sulfosalicylic 3%, ly tõm 7000 vũng/phỳt trong thời gian 20 phỳt, lọc lấy dịch lọc. Lấy 2 ml dịch chiết cho vào bỡnh, thờm 2 ml axit axetic và 2 ml dung dịch ninhydrin, ủ trong nước núng 1000C trong thời gian 1 giờ sau đú ủ nước đỏ 5 phỳt. Bổ sung vào bỡnh phản ứng 4 ml toluen, lắc đều. Lấy phần dịch màu hồng ở trờn đem đo mật độ quang học (OD - Optical density) ở bước súng = 520 nm
trờn mỏy UV – Visible - Spectrophotometer, UV - 2450 do hóng SHIMADZU - Mỹ sản xuất. Hàm lượng axit amin prolin được tớnh theo cụng thức (cụng thức được suy ra từ việc lập đường chuẩn prolin):
Y = 1,4083 x X + 0,014 R2 = 0,9991 Trong đú: Trong đú:
Y: Nồng độ prolin (mg/l).
X: giỏ trị OD đo được ở bước súng = 520 nm. R2: Là hệ số tương quan.
Y x V A =
P x 1000
A: Hàm lượng prolin (mg/g) P: Khối lượng mẫu (g)
V: Thể tớch dịch prolin chiết được
Tất cả cỏc axit amin đều phản ứng màu với ninhydrin tạo thành hợp chất màu xanh tớm, riờng imino axit như prolin tạo thành màu vàng với cơ chế phản ứng phức tạp. Hợp chất màu vàng cú cực đại hấp thụ ở bước súng = 520 nm.
*Xỏc định hàm lượng nitơ tổng:
Nitơ tổng được xỏc định bằng phương phỏp Microkjeldahl [1], [22] trờn mỏy cất đạm tự động với hệ thống chưng cất UDK 142 và bộ cụng phỏ mẫu DK6 của hóng VELP – Italia. Mẫu được sấy ở 1050C, nghiền nhỏ, cõn lấy 1g mẫu cho vào mỗi ống nung. Húa chất cho vào mỗi ống nung: 7g K2SO4, 5mg bột Se, 12ml H2SO4 96%, 5ml H2O2 35%. Nung mẫu tại 4200C trong 20 phỳt, làm mỏt đến 50 - 600C thỡ đem chưng cất. Chưng cất theo chương trỡnh đặt: 50ml H2O, 50ml NaOH 32%, thời gian chưng 3 phỳt, luồng hơi 100%, cho vào bỡnh hứng 25ml H3BO4 4%. Chuẩn độ sản phẩm thu được (cho 10 giọt dung dịch chỉ thị) và chuẩn độ với dung dịch HCl 0,2N.
Hàm lượng nitơ tổng số được tớnh theo lượng HCl dựng để chuẩn độ, đơn vị là mg/g (1ml HCl 0,2N = 2,803 mg N -NH4 cú trong mẫu).
Hàm lượng nitơ được xỏc định theo cụng thức; V x 2,803
N = W W
Trong đú; N: Hàm hượng nitơ (mg/g chất khụ) V: Là số ml HCl chuẩn độ
W: Khối lượng mẫu tớnh bằng (g).
2,803 là hệ số chuyển mg nitơ ứng với 1ml HCl 0,2N.
2.2.4. Phương phỏp xử lý số liệu
Kết quả nghiờn cứu được tổng hợp và xử lý theo phương phỏp thống kờ
toỏn học qua cỏc thụng số: trung bỡnh số học ( X ), độ lệch chuẩn ( ), sai số trung
bỡnh (m), hệ số biến động (CV), độ chớnh xỏc của thớ nghiệm (m%), tiờu chuẩn độ tin của hiệu (td). Tiờu chuẩn độ tin của hiệu (td) được so trong bảng phõn phối Student với số bậc tự do: (n1+ n2 - 2) với mức ý nghĩa α = 0,05.
1N N i i X X n , 2 1 i X X n , .100 CV X , m n % m X , 2 2 1 2 d m m m , d XDC XTN , d d d t m
Cỏc tớnh toỏn được thực hiện trờn cơ sở sử dụng những ứng dụng của phần mềm Microsoft Excel. Trong mỗi bảng số liệu, số liệu so sỏnh giữa thớ nghiệm và đối chứng kốm theo dấu * thể hiện cú sự sai khỏc cú ý nghĩa thống kờ với độ tin cậy α = 0,05.