trong các test thanh lọc sẽ được tái sinh thành cây để khảo sát tính chống chịu của chúng.
- Một số hệ thống chọn lọc:
+ Chọn lọc dòng tế bào kháng kháng sinh, các dòng tế bào kháng sâu bệnh, chịu thuốc trừ cỏ, chịu điều kiện bất thuận, và các dòng tế bào có khả năng sinh trưởng trên các amono acid đặc thù trong số những acid amin khác.
+ Chọn các dòng tế bào có khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp.
* Biến nạp di truyền
- Nhận biết gen thông qua chức năng sinh học ( tính trạng liên quan đến đặc điểm hình thái, đặc điểm chức năng…). Xác định điều kiện đặc trưng cho quá trình biểu hiện và kìm hãm gen.
- Gen gắn với các vectơ: thông thường người ta sử dụng các loại plasmid mang gen kháng sinh để tiện lợi cho việc chọn lọc sản phẩm biến nạp sau này.
- Chuyển gen vào protoplast: có nhiều phương pháp chuyển gen bằng hoá học, xung điện, súng bắn gen, thông qua vi khuẩn Agrobacterium.
- Chọn lọc sản phẩm biến nạp.
- Đánh giá kết quả và theo dõi biểu hiện của gen biến nạp. Protoplast ngay sau khi tách
Tế bào giống, loài A Tế bào giống ,loài B
Câu 7. Trình bày kỹ thuật bảo quản nguồn gen in vitro --- o 0 o ---
a. Mục đích của bảo quản nguồn gen in vitro
Mục đích cơ bản của việc bảo quản nguồn gen thực vật là duy trì sự phong phú đa dạng di truyền trong loài, giữa các loài và trong hệ sinh thái nói chung để làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng chúng một cách hợp lý cho hiện tại và trong tương lai. b. Các phương pháp bảo quản nguồn gen truyền thống
Có 2 phương thức bảo quản nguồn gen cây trồng
- Bảo quản Insitu là bảo quản tại chỗ, cây được duy trì tại điều kiện sinh thái tự nhiên của chúng.
- Bảo quản Ex-situ là bảo quản các mẫu trong điều kiện nhân tạo tối ưu. Bảo quản ex xitu đóng vai trò quan trọng trong xây dựng các ngân hàng gen và được sử dụng rộng rãi cho bất kì loại cây trồng nào.
Những hình thức bảo quản ex xitu khác nhau
+ Bảo quản cây trong vườn ươm tạo thành field bank. + Bảo quản hạt trong kho lạnh tạo thành seed bank. + Bảo quản in vitro tạo thành in vitro bank.
+ Bảo quản ADN tạo thành DNA bank.
Trong bốn phương thức trên, phương thức bảo quản in vitro có vai trò quan trọng vì bảo quản trong một không gian hẹp nhưng có thể lưu giữ một số lượng lớn cá thể, điều kiện bảo quản hoàn toàn chủ động và là biện pháp có hiệu quả đối với các cây trồng nhân vô tính và hạt cây dễ mất sức nảy mầm ở nhiệt độ và ẩm độ thấp.
c. Kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật in vitro
Có hai phương pháp bảo quản in vitro: bảo quản sinh trưởng tối thiểu và bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thời
- Phương pháp bảo quản sinh trưởng tối thiểu.
+ Nguyên lý: mẫu được bảo quản trong điều kiện bảo quản sao cho tốc độ sinh trưởng của mẫu giảm tới mức tối thiểu.
+ Đặc điểm:
• Đặc điểm của phương pháp này là kéo dài thời gian giữa hai lần cấy chuyển nhờ ức chế sinh trưởng của mẫu cấy để giảm tới mức tối thiểu chi phí trong quá trình bảo quản.
• Trong thời gian bảo quản mô và tế bào thực vật vẫn tiếp tục sinh trưởng nhưng với tốc độ rất chậm.
• Thời gian bảo quản sinh trưởng chậm có thể kéo dài một vài năm.
+ Đối tượng: phương pháp này thường áp dụng cho việc bảo quản ngắn hạn các cây nhân giống in vitro (chuối, dứa, khoai tây, khoai lang…). Mẫu đưa vào bảo quản thường ở các dạng phôi, chồi, mầm, cây con.
+ Các bước tiến hành:
• Đưa mẫu vào môi trường nuôi cấy có bổ sung các nhân tố nhằm ức chế sinh trưởng. Các nhân tố gây ức chế sinh trưởng thường dùng là:
Giảm nhiệt độ của phòng nuôi. Với loài cây chịu lạnh nhiệt độ bảo quản từ 0÷50C. Ví dụ: chồi cây thông và cây táo giữ được 52 tuần ở 20C, khoai tây bảo quản ở 6÷120C có thời gian cấy chuyển là 25÷52 tuần. Những loài cay nhiệt đới thường bảo quản ở nhiệt độ cao hơn. Ví dụ: chuối giữ được 15 tháng ở 150C, cọ dầu bảo quản ở 180C.
Chất ức chế sinh trưởng: bổ sung vào môi trường nuôi cấy ABA (axit abcisic), CCC (Clo Cholin Clorit).
Chất gây áp suất thẩm thấu: manitol, sorbitol, saccarose.
Thay đổi điều kiện nuôi cấy: giảm cường độ chiếu sáng, giảm nồng độ ôxi…
Ví dụ: nuôi cấy khoai tây ở 220C và môio trường có 5÷10mg/l ABA thì thời gian cấy chuyển kéo dài tới 12 tháng; cây sắn nuôi cấy ở 200C trong môi trường có 4% saccarose có thể kéo dài thời gian cấy chuyển tới 15 tháng.
• Khi kết thúc một giai đoạn bảo quản, mẫu bảo quản cần được chuyển sang môi trường mới pha chế và đặt trong điều kiện tối thích một thời gian ngắn để kích thích sự tái sinh trưởng của mẫu trước khi bắt đầu một chu kỳ bảo quản mới.
Ví dụ: bảo quản sinh trưởng chậm cây khoai tây Thời gian chuẩn bị mẫu: 8 tuần. Thời gian bảo quản: 2 năm. Nhiệt độ: 100C.
Thời gian chiếu sáng:16h. Cường độ chiếu sáng: 1500lux. Độ ẩm: 60÷70%.
- Phương pháp bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thời
+ Nguyên lý: bảo quản mẫu bằng cách làm mẫu ngừng sinh trưởng tạm thời. + Đặc điểm:
• Đặc điểm của kỹ thuật này là mẫu nuôi cấy được bảo quản trong nitơ lỏng, và trong thời gian bảo quản tế bào mô hoàn toàn ngừng sinh trưởng.
• Có thể bảo quản mẫu được 20÷30 năm hoặc lâu hơn.Trước khi đưa vào bảo quản mẫu cần được xử lý để tránh tạo thành các tinh thể nước kết tinh gây chết mẫu. + Đối tượng: mẫu đem bảo quản thường ở dạng phôi, mô sẹo, các mô nuôi cấy…
+ Các bước tiến hành:
• Nuôi cấy in vitro và tách mẫu ở pha tăng trưởng mạnh để đưa vào bảo quản. • Xử lý chống đông cho tế bào, mô của mẫu cấy: mẫu được xử lý bằng dung dịch 5÷10% prolin, manitol 3÷6% có bổ sung chất chống đông là dung dịch DMSO 1M+ glycerol 1M+ đường saccarose 2M…
• Xử lý lạnh đến nhiệt độ đông băng ổn định của tế bào chất (-30÷-400C) • Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -1960C (trong nitơ lỏng).
Mẫu sau thời gian bảo quản khi lấy ra được phá băng ở nhiệt độ 37÷400C. Mẫu sẽ được phục hồi sinh trưởng và có thể tiếp tục nuôi cấy để tạo cây hoàn chỉnh.
Chuyên đề 8. Vì sao có thể chuyển gen vào cây trồng thông qua vi khuẩn