8T ng hợp tình hình nghiên cứu trong và ngồi nướ cv hướng đ tài

M ĐU

1.8T ng hợp tình hình nghiên cứu trong và ngồi nướ cv hướng đ tài

Đối với nh ng vấn đ liên quan đến luận án, sau khi thực hiện xong phần T ng quan tài liệu, chúng tơi c một số nhận đ nh như sau:

T i Việt Nam đã c một số nghiên cứu v phư ng pháp cố đ nh nấm men trong gel alginate. Lê Th Lan Chi 2 , 2 1 đã xác đ nh đi u kiện k thuật thích hợp như mật độ tế bào trong gel là , .107

tb/mL; nồng độ alginate trong gel là 2, w v và nồng độ dung d ch CaCl2 là 1%w/v đ lên men d ch nha 12oPt sản suất bia [185], [186]. Trần Quốc Hi n 2 đã xác đ nh l i các đi u kiện k thuật đ cố đ nh nấm men trong gel alginate và ứng d ng lên men d ch nha 2 oPt đ sản xuất bia nồng độ cao [47].

Bên c nh ứng d ng trong sản xuất bia, các nghiên cứu trong nước tập trung khảo sát ứng d ng nấm men cố đ nh trong gel alginate đ lên men sản xuất ethanol. Ngơ Đ ng Ngh a 1 , 1 đã chiết xuất alginate từ nguồn rong m của Việt Nam và th nghiệm lên men ethanol trên mơi trư ng d ch đư ng glucose [187], [188]. Đến

-22-

n m 2 , Bùi Thanh Huy n đã thay đ i nồng độ glucose 1 -2 g L trong mơi trư ng t ng hợp và nhận thấy nấm men cố đ nh luơn c tốc độ lên men cao h n khoảng 1,3-2, lần và nồng độ ethanol trong d ch dấm chín cao h n khoảng 1, -2,2 lần so với nấm men tự do [189]. Ph m Tr ng Khoa (2003) đã s d ng nấm men cố đ nh trong gel alginate đ lên men sản xuất ethanol theo phư ng pháp liên t c trong khoảng th i gian 3 - ngày với tốc độ pha lỗng là , 12 h-1. Sản ph m t o thành cĩ hàm lượng ethanol dao động trong khoảng , -7,4 % (v/v) [190].

Đến nay, chúng tơi chưa tìm thấy cơng bố của các nhà khoa h c trong nước v ứng d ng nấm men cố đ nh trong gel alginate đ lên men rượu vang nho.

Ngồi nước, đã c khá nhi u cơng trình nghiên cứu v s d ng nấm men cố đ nh trong gel alginate đ lên men rượu vang, s d ng phư ng pháp lên men t nh tái s d ng nấm men nhi u chu kỳ và phư ng pháp lên men liên t c. Đ là nh ng nghiên cứu của Fumi (1988) [57], Suzzi (1996) [63], Bakoyianis (1997) [21], Yajima (2001) [172], Silva (2002) [64], Ciani (2006) [183], Kassim (2012) [39].

Tuy nhiên, c một số vấn đ mà nh ng cơng bố trên thế giới chưa đ cập đến:

i. c định c c điều i n thích hợ ch u t nh cố định tế nấm m n t ng hạt

gel alginate bằng h ơng h u h ạch thực nghi m: Nh ng nghiên cứu trước

đây đã xác đ nh các thơng số của quá trình cố đ nh tế bào nấm men trong gel alginate b ng phư ng pháp thực nghiệm c đi n chưa c cơng bố s d ng phư ng pháp quy ho ch thực nghiệm đ tìm các đi u kiện thích hợp cho quá trình cố đ nh tế bào nấm men trong gel alginate.

ii. Kh s t u t nh n m n ợu vang hi t i sử ụng nấm m n cố định t ng g

a ginat ua c c chu : Các nghiên cứu trước đây thư ng quan tâm đến hiệu quả

tái s d ng nấm men cố đ nh như số chu kỳ tái s d ng, th i gian lên men của m i chu kỳ, hiệu suất sinh t ng hợp ethanol, chất lượng rượu vang thu được qua các chu kỳ. Tuy nhiên, các nghiên cứu chưa khảo sát khả n ng sinh trư ng, s d ng c chất và sinh t ng hợp ethanol khi tái s d ng nấm men cố đ nh. Ngồi ra, chưa c cơng bố khoa h c nào đ cập đến giải pháp ngâm h t gel alginate trong dung d ch CaCl2 sau m i chu kì lên men đ làm b n h t. Đối với phư ng pháp lên men liên t c, đã c một nghiên cứu của Baykoyanis 1 v việc b sung muối CaCl2 trực tiếp vào d ch nho trước khi châm vào thiết b lên men đ làm b n h t gel alginate

-23-

tuy nhiên giải pháp này làm cho nồng độ Ca2+ trong rượu vang t ng cao và khơng n đ nh [21].

iii. Thiết ậ h ơng t nh cân ằng vật chất ch u t nh n m n ợu vang sử ụng

nấm m n cố định t ng g a ginat : Chưa c cơng bố khoa h c nào trước đây đ

cập đến vấn đ này.

Trong nước, nghiên cứu của Nguy n Thúy Hư ng 2003, 2006 v việc cố đ nh

Oenococcus oeni trên cellulose vi khu n b ng phư ng pháp hấp ph -ủ đã là ti n đ đ

chúng tơi ho ch đ nh các nghiên cứu cố đ nh nấm men trên chất mang cellulose vi khu n [145], [149]. Nguy n Thúy Hư ng 2 c ng c một cơng bố khoa h c v cố đ nh nấm men trên cellulose vi khu n. Tác giả đã so sánh khả n ng cố đ nh tế bào nấm men trên hai lo i cellulose vi khu n d ng màng và d ng h t đồng th i tiến hành tái s d ng nấm men cố đ nh qua chu kỳ lên men [28]. Tuy nhiên trong nghiên cứu này, các tác giả đã xác đ nh nh ng thơng số của quá trình cố đ nh tế bào theo phư ng pháp c đi n, khơng s d ng phư ng pháp quy ho ch thực nghiệm. Ngồi ra, động h c quá trình lên men các chu kỳ tái s d ng chưa được cơng bố.

Ngồi nước, đã c khá nhi u cơng trình khoa h c v việc s d ng chất mang giàu cellulose từ thực vật đ cố đ nh nấm men. Tuy nhiên chúng tơi ch mới tìm thấy một báo cáo của ao 2 11 s d ng cellulose vi khu n làm màng membrane cố đ nh nấm men và ứng d ng trong sản xuất ethanol. Khi đ , hàm lượng ethanol thu được t ng 21,2 và tốc độ sinh t ng hợp ethanol t ng 31,3 so với nấm men tự do đối chứng [29].

-24-

C 2 NG N I HƯƠNG HÁ NGHI N C U

2.1 Nguyên li u

2.1.1 ấ

Nấm men Saccharomyces cerevisiae TSV09 được cung cấp b i ph ng thí nghiệm Vi sinh thực ph m, bộ mơn Cơng nghệ Thực ph m, trư ng Đ i h c Bách Khoa. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Đặc điểm h nh th i

- Tế bào hình cầu

- Sinh sản vơ tính b ng cách nảy chồi, hoặc b ng bào t - Bào t hình tr n hoặc ellipse.

Kh n ng lên men t ng điều i n hơng c

D-Glucose + D-Galatose + Maltose + Sucrose + α,α-Trehalose + Melibose + Raffinose + Lactose - Cellobiose - Inulin - Starch - D-Xylose - n m n đ ợc - hơng n m n đ ợc

Độ n m n cuối c ng trên mơi trư ng d ch nho nồng độ đư ng kh 2 g L là 8%.

Kh n ng sinh t ng: D-Glucose + D-Galactose + Maltose + α,α-Trehalose + Sucrose + Melibiose + Raffinose + L-Sorbose - D-Ribose - D-Xylose - Arabinose - L-Rhamnose - Cellobiose - Lactose - Melezitose - Inuline - Starch - Glycerol - Erythritol - Ribitol - L-Arabinitol - D-Glucitol - D-Manitol - Galactitol - myo-Inositol - D-Gluconate - D-Glucuronate - D-Galacturonate - DL-Lactate - Succinate - Citrate - Methanol - Ethanol - Propane 1,2 diol - Butane 2,3 diol - Nitrate - Nitrite - Ethylamine - L-Lysine - Creatine - Creatinine - Glucosamine - Imidazole - w/o vitamins + w/o myo-Inositol -

w/o Biotin + w/o Thiamin + w/o Biotin/Thiamin + w/o Pyridoxine + w/o Niacin + 25oC + 30oC + 35oC + 37oC + 40oC + 0.01% Cycloheximide - 0.1% Cyclohexamide - 1% Acid Acetic - 50% D-Glucose - 60% D-Glucose -

c thể sinh t ng - hơng thể sinh t ng

2.1.2 Alginate

Chất mang alginate được tách chiết từ rong m , thuộc giống Sargassummeclurei,

do Viện Cơng nghệ Sinh h c trư ng Đ i h c Nha Trang cung cấp. Chế ph m alginate s d ng trong luận án c d ng v y r n, màu nâu nh t, độ m 2 , , độ nhớt của dung d ch alginate 2 2 oC là 3 Cp, t lệ M G là 1,2 [188].

-25-

2.1.3 C ll l v ẩ

Cellulose vi khu n được thu nhận từ quá trình lên men nước dừa già theo phư ng pháp lên men b mặt, s d ng vi khu n Acetobacter xylinum BC12 do bộ mơn Cơng nghệ Sinh h c, trư ng Đ i h c Bách Khoa cung cấp. Quy trình thu nhận chất mang được trình bày ph l c 1.1. Chất mang cellulose vi khu n c d ng tấm màu tr ng ngà, độ m 3 , độ dày mm, được c t thành nh ng khối hình hộp ch nhật c kích thước khác nhau theo ho ch đ nh thí nghiệm.

2.1.4 Nho

Nho Shiraz và Red Cardinal được mua từ các vư n nho Ninh Thuận. Nho được

đem ép lấy d ch rồi tr đơng -40oC đ d ng trong suốt quá trình thí nghiệm. Quy trình thu nhận d ch nho được trình bày trong ph l c 1.2. Thành phần của các d ch nho sau khi ép được trình bày trong bảng 2.1.

Bảng 2.1. Thành phần của các d ch nho sau khi ép

T Đ G

Red Cardinal Shiraz

pH 3,71 3,45 Độ chua g a.tartaric/100mL 0,65 1,45 Đư ng kh g/L 115 152 Hàm lượng chất khơ oBx 12 16 Nit amin tự do ppm 172 225 Nit ammonium ppm 45 215 Tannin g/L 1,8 5,8 SO2 t ng ppm 12 45 2.1.5 Cá l ấ á 2.1.5.1 H a chất ổ sung v ịch n m n

Đư ng glucose, (NH4)2HPO4, Na2S2O5, tannic acid, tartaric acid đ b sung vào d ch lên men là các lo i h a chất tinh khiết c xuất xứ từ cơng ty Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd và Guangdong Xilong Chemical Co., Ltd, Trung Quốc.

2.1.5.2 H a chất hân tích

Các h a chất d ng đ thực hiện phân tích đ nh lượng c xuất xứ từ hãng Merck Co., Inc, Đức và Sigma Chemical Co., Hoa Kỳ.

-26-

2.2 Nộ

 ác đ nh các thơng số thích hợp cho quá trình cố đ nh tế bào nấm men trong gel alginate và trên cellulose vi khu n b ng phư ng pháp quy ho ch thực nghiệm.  Khảo sát và so sánh ho t tính lên men của nấm men cố đ nh trong gel alginate, nấm

men cố đ nh trên cellulose vi khu n và nấm men tự do trong quá trình lên men chính rượu vang nho.

 Khảo sát quá trình lên men rượu vang qua các chu kỳ tái s d ng và so sánh khả n ng tái s d ng của nấm men cố đ nh trong gel alginate và nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

 ác đ nh phư ng trình cân b ng vật chất của quá trình lên men chính trong sản xuất rượu vang nho cho nấm men cố đ nh trong gel alginate, nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n và nấm men tự do, từ đ so sánh một cách tồn diện v hiệu suất sinh t ng hợp các sản ph m lên men của chúng.

2.3

2.3.1 ơ á ể

Chúng tơi thay đ i giá tr một thơng số cần khảo sát, cố đ nh giá tr các thơng số c n l i, từ đ xác đ nh quy luật biến đ i của hàm m c tiêu theo thơng số khảo sát.

2.3.2 ơ á ự ự ế

Chúng tơi thay đ i đồng th i hai thơng số cần khảo sát theo ma trận quy ho ch thực nghiệm nh m đánh giá sự ảnh hư ng đồng th i của hai yếu tố đến hàm m c tiêu và xác đ nh giá tr của hai yếu tố đ hàm m c tiêu đ t giá tr cực đ i.

-27- 2.4 thí nghi m  ác đ nh các đi u kiện thích hợp đ cố đ nh nấm men b ng quy ho ch c đi n  ác đ nh các đi u kiện thích hợp đ cố

đ nh nấm men trong gel alginate b ng phư ng pháp quy ho ch thực nghiệm

 ác đ nh các đi u kiện thích hợp đ cố đ nh nấm men theo phư ng pháp hấp ph  ác đ nh th i gian ủ đ cố đ nh nấm men

theo phư ng pháp hấp ph -ủ

 So sánh ho t tính lên men của nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n theo hai phư ng pháp hấp ph và hấp ph -ủ

ả ả ,

 Khảo sát khả n ng sinh trư ng của nấm men cố đ nh và nấm men tự do

 Khảo sát khả n ng chuy n h a c chất của nấm men cố đ nh và nấm men tự do  Khảo sát khả n ng sinh t ng hợp sản ph m của nấm men cố đ nh và nấm men tự do

ả ả

T â uá trình lên men vang

 Khảo sát hiệu quả quá trình ngâm h t gel alginate trong dung d ch CaCl2 sau m i chu kỳ tái s d ng

 So sánh khả n ng tái s d ng của nấm men cố đ nh trong gel alginate và trên cellulose vi khu n

-28-

2.5 B trí thí nghi m

2.5.1 á á ể ấ l l xác đ nh các đi u kiện thích hợp đ cố đ nh nấm men trong gel Ca alginate. Nấm men cố đ nh thu được s được d ng cho các thí nghiệm khảo sát ho t tính lên men và khả n ng tái s d ng theo phư ng pháp lên men t nh - nhi u chu kỳ trong quá trình lên men rượu vang.

2.5.1.1 Kh s t nh h ng của c c ếu tố t ng u t nh cố định nấm m n trong gel

alginate ằng quy h ạch cổ điển

Bên c nh yếu tố mật độ tế bào trong huy n ph giống, các yếu tố nồng độ dung d ch alginate và nồng độ dung d ch CaCl2 đ u c ảnh hư ng đến hiệu suất cố đ nh nấm men trong h t gel và khả n ng lên men của nấm men cố đ nh. Khoảng khảo sát của các yếu tố này được ch n dựa trên kết quả của nh ng cơng bố khoa h c của các tác giả trong và ngồi nước [21], [177], [182].

Yế tiến hành 3 lo t thí nghiệm đ thay đ i lần lượt 3 yếu tố của quá trình cố đ nh nấm men trong gel Ca alginate bảng 2.2 .

á : hiệu suất cố đ nh tế bào nấm men trong gel Ca alginate, ho t tính lên men của tế bào cố đ nh th i gian lên men, hàm lượng ethanol trong rượu vang non , độ b n h t gel độ cứng h t gel, t lệ thốt bào, t lệ h t v .

Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hư ng các yếu tố đến hiệu quả cố đ nh nấm men trong gel Ca alginate

TN 1 Nồng độ dung d ch alginate, 2–3–4–5–6%  Mật độ huy n ph giống: 100.106 tb/mL  Nồng độ dung d ch CaCl2: 2% 2 Mật độ huy n ph giống, 50–100–200–300–500.106 tb/mL

 Nồng độ dung d ch alginate được ch n từ kết quả TN1  Nồng độ dung d ch CaCl2: 2%

3 Nồng độ dung d ch CaCl2, 1–2–3–4% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

 Nồng độ dung d ch alginate được ch n từ kết quả TN1  Mật độ huy n ph giống được ch n từ kết quả TN2

Cá ự

 Quy trình cố đ nh nấm men trong gel alginate được trình bày trong ph l c 1.3. Sau quá trình cố đ nh, chúng tơi lấy mẫu đ xác đ nh hiệu suất cố đ nh tế bào và độ cứng h t gel. D ch nho s d ng là ed Cardinal.

-29-

 Nấm men cố đ nh s được đem lên men rượu vang đ ki m tra ho t tính lên men. Chúng tơi s d ng 2 mL d ch nho Red Cardinal, với thành phần h a h c được hiệu ch nh theo bảng 2.3, mật độ giống cấy nấm men ban đầu là .1 6 tb mL d ch nho, nhiệt độ lên men là 22 – 25oC. Quá trình lên men kết thúc khi nồng độ chất khơ của d ch lên men khơng đ i trong 12h liên tiếp.

Bảng 2.3. Các chất b sung vào d ch nho Red Cardinal đ thực hiện quá trình lên men s d ng của nấm men cố đ nh trong gel Ca alginate

Thơng số Chất b sung Giá tr sau khi đã hiệu ch nh

Đư ng t ng Glucose 240g/L