Các mẫu của vị thuốc khiếm thực nghiên cứu, trước khi tiến hành phân lập và phân loại các chủng nấm nhiễm đã được xác định hàm ẩm. Kết quả hàm ẩm của 10 mẫu khiếm thực được trình bày trong bảng 3.5 dưới đây.
Bả ng 3.5. Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc khiếm thực nghiên cứu
TT Mẫu Hàm ẩm TT Mẫu Hàm ẩm
1 69A LÔ 13,5 6 50 LÔ 12,58
2 24 LÔ 14,46 7 55 LÔ 10,43
3 30 LÔ 14,05 8 57 LÔ 13,77
4 32 LÔ 12,33 9 63 LÔ 15,88
5 36 LÔ 15,43 10 28 LÔ 14,58
3.2.2. Mức độ nhiễm các loài của chi Aspergillus trên các mẫu vị thuốc khiếm thực nghiên cứu thực nghiên cứu
a) Kết quả phân lập và phân loại
Kết quả phân lập và phân loại các chủng nấm thuộc chi Aspergillus
nhiễm trên 10 mẫu của vị thuốc khiếm thực nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.6.
25
Bả ng 3.6. Các loài và số lượng chủng của chi Aspergillus phân lập được từ 10 mẫu vị thuốc khiếm thực nghiên cứu
Với kết quả thu được từ bảng 3.6 cho thấy: Từ 10 mẫu khiếm thực nghiên cứu đã phân lập được 191 chủng nấm thuộc 7 loài của chi Aspergillus gồm A.
flavus, A. parasiticus, A. niger, A. fumigatus, A. tamarii, A. terreus và A. ustus.
Trong đó, loài A. flavus (hình 3.5) chiếm tỷ lệ cao nhất về số chủng phân lập được (chỉ số có nhiều), với tỷ lệ 36,65% (70/191). Tuy nhiên, tỷ lệ các mẫu nghiên cứu có mặt loài này chỉ ở mức 40% (4/10 mẫu nghiên cứu). Xếp thứ 2 là loài A. niger (hình 3.6) có tỷ lệ số chủng phân lập được là 34,03% (65/191), với chỉ số có mặt là 80% (8/10 mẫu nghiên cứu). Xếp thứ 3 là loài A. fumigatus (hình 3.7), với các chỉ số có nhiều và có mặt lần lượt là 10,99% (21/191) và 50% (5/10). Xếp thứ 4, thứ 5, thứ 6 và thứ 7 lần lượt là các loài A. terreus (hình 3.8), A. parasiticus, A. tamarii và A. ustus với các chỉ số có nhiều và chỉ số có mặt theo thứ tự là: 7,85% (15/191) và 40% (4/10); 4,71% (9/191) và 40% (4/10); 3,66% (7/191) và 40% (4/10); 2,09 (4/191) và 20% (2/10). Tên loài (Aspergillus) 69A LÔ 24 LÔ 30 LÔ 32 LÔ 36 LÔ 50 LÔ 55 LÔ 57 LÔ 63 LÔ 28 LÔ Tổng Tỷ lệ (%) A. flavus 2 65 1 2 70 36,65 A. parasiticus 1 5 2 1 9 4,71 A. niger 3 5 2 27 6 4 2 16 65 34,03 A. fumigatus 5 5 1 2 8 21 10,99 A. tamarii 1 1 4 1 7 3,66 A. terreus 3 5 5 2 15 7,85 A. ustus 1 3 4 2,09 Tổng 5 8 14 13 4 32 73 11 5 26 191 100 (%)
26
b) Một số đặc điểm khuẩn lạc và vi học quan trọng của các loài phân lập được từ 10 mẫu khiếm thực nghiên cứu
Để khảo sát đặc điểm sinh học (khuẩn lạc, vi học, ...), các chủng nấm được cấy đơn tại 3 điểm trên các đĩa Petri chứa môi trường Czapek Dox Agar và ủ ở 25oC sau 5 ngày. Bảng 3.7 dưới đây là một số đặc điểm khuẩn lạc quan trọng của các loài phân lập được từ các mẫu khiếm thực nghiên cứu.
Bả ng 3.7. Một số đặc điểm khuẩn lạc của các loài thuộc chi Aspergillus phân lập được từ các mẫu khiếm thực nghiên cứu
(môi trường Czapek Dox, 25oC, 5 ngày tuổi)
Tên loài Màu sắc khuẩn lạc Đường kính khuẩn lạc
(cm)
Mặt phải Mặt trái
A. flavus Xanh hơi vàng Không màu 3-5,5
A. parasiticus Xanh Trắng xám 2,5-4
A. niger Nâu tím Không màu 3,5-5,5
A. fumigatus Xanh tối Xám tối 3-5
A. tamarii Nâu vàng Trắng xám 3-5,5
A. terreus Nâu quế Xám hơi vàng 3-5
A. ustus Kem, hơi vàng Hơi vàng tối 4-5,5
Một số đặc điểm vi học các loài thuộc chi Aspergillus phân lập được
27
Bả ng 3.8. Một số đặc điểm vi học của các loài thuộc chi Aspergillus phân lập được từ các mẫu khiếm thực nghiên cứu
(môi trường Czapek Dox, 25oC, 5 ngày tuổi)
Tên loài Cấu trúc sinh conidi (conidial head) Đường kính bọng (µm) Cuống thể bình (µm) Thể bình (µm) Conidi (µm) Dạng Tầng A. flavus R 2 22-47 6-11 x 2,5-5 5,5-10 x 4-6 3-4 A. parasiticus R 1 18-36 6,5-9,5 x 2,5-4 3,5-6 A. niger R 2 45-105 14-27 x 4-6,5 6-10 x 2,5-4 3-5 A. fumigatus C 1 18-32 5,5-8,5 x 2-3,5 2-3,5 A. tamarii R-C 2 25-55 6,5-10 x 3,5-6 9-16 x 3,5-8,5 5-8 A. terreus C 2 9-21 4,5-7,5 x 2-3 4,5-7 x 1,5-2,5 1-3 A. ustus R 2 6-17 5-7,5 x 2,5-3,5 4-7,5 x 3-4,5 3-5 (Ghi chú. R: dạng phóng xạ; C: dạng cột)
28
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
Hình 3.5. Loài A. flavus nhiễm trên vị thuốc khiếm thực:
(a): Loài A. flavus nhiễm trên mẫu 55LÔ (môi trường phân lập PDA); (b) và (c): Mặt trước và sau khuẩn lạc của loài trên Czapek Dox (25oC, 5 ngày);
(d): Conidi, cấu trúc sinh conidi 1 và 2 tầng của loài.
29
(a) (b)
(c) (d)
Hình 3.6. Loài A. niger nhiễm trên vị thuốc khiếm thực:
(a): Loài A. niger nhiễm trên mẫu 50LÔ (môi trường phân lập PDA); (b) và (c): Mặt trước và sau khuẩn lạc của loài trên Czapek Dox (25oC, 5 ngày);
30
(a) (b)
(c) (d)
Hình 3.7. Loài A. fumigatus nhiễm trên vị thuốc khiếm thực:
(a): Loài A. fumigatus nhiễm trên mẫu 28LÔ (môi trường phân lập DGM); (b) và (c): Mặt trước và sau khuẩn lạc của loài trên Czapek Dox (25oC, 5 ngày);
31
(a) (b)
(c) (d)
Hình 3.8. Loài A. terreus nhiễm trên vị thuốc khiếm thực:
(a): Loài A. terreus nhiễm trên mẫu 32LÔ (môi trường phân lập DGM); (b) và (c): Mặt trước và sau khuẩn lạc của loài trên Czapek Dox (25oC, 5 ngày);
32
3.2.3. Một số ý kiến bàn luận
Từ kết quả xác định hàm ẩm của các mẫu khiếm thực nghiên cứu (bảng 3.5) và kết quả phân lập, phân loại (bảng 3.6) cho thấy: Trong 10 mẫu nghiên cứu, chỉ có 3 mẫu 32LÔ, 50LÔ và 55LÔ có hàm ẩm đạt yêu cầu của DĐVN IV
(≤ 13%) [2], 7 mẫu còn lại đều có hàm ẩm không đạt yêu cầu (˃ 13%), dao động
từ 13,5 – 15,88%. Tất cả 10 mẫu nghiên cứu đều bị nhiễm nấm mốc, với số chủng phân lập được trên mỗi mẫu dao động từ 4 - 73 chủng. Trong số này, điều đáng chú ý là, mẫu có số chủng phân lập được cao nhất (55LÔ) với 73 chủng là mẫu có hàm ẩm thấp nhất trong số 3 mẫu có hàm ẩm đạt yêu cầu của DĐVN IV (10,43%). Giải thích cho kết quả này, theo chúng tôi là do các mẫu được thu thập để nghiên cứu, không kiểm soát được nguồn gốc, xuất xứ. Các mẫu dược thảo này có thể đã bị nhiễm nấm trước thời điểm thu thập ở các hiệu thuốc đông dược (có thể đã bị nhiễm trước ở ngoài đồng ruộng, trang tại, trong quá trình thu hoạch, vận chuyển, chế biến và bảo quản). Mặt khác, khiếm thực chứa nhiều tinh bột – thành phần cơ chất thích hợp cho sự phát triển nấm mốc, là điều kiện thuận lợi cho nấm Aspergillus lây nhiễm và phân lập được nhiều trên vị thuốc này.
Với kết quả phân lập, phân loại nấm từ 10 mẫu khiếm thực được trình bày ở bảng 3.6 cho thấy:
• Loài A. flavus phân lập được nhiều nhất (36,65%), mặc dù chỉ số có mặt trên các mẫu khiếm thực nghiên cứu không cao (40%). Đây là một trong hai loài nấm có khả năng sinh độc tố aflatoxin [6], [16], [24], cho thấy các mẫu của vị thuốc khiếm thực nghiên cứu có nguy cơ cao bị nhiễm độc tố gây ung thư này. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Sinha và cộng sự 2002 [30], cho thấy nhóm loài A. flavus nhiễm trên các mẫu
khiếm thực nghiên cứu. Trong đó, 30% các mẫu bị nhiễm độc tố aflatoxin, và hàm lượng aflatoxin B1 lên tới 12 µg/g.
33
• Loài A. niger phân lập được với tỷ lệ chủng thứ 2 (nhưng chỉ số có mặt trên các mẫu nghiên cứu cao gấp đôi so với loài A. flavus), cho thấy các mẫu của vị thuốc này có khả năng cao bị nhiễm độc tố gây hại thận ochratoxin, bởi
A. niger có khả năng sinh ochratoxin [16]. Kết quả này cũng phù hợp với
nghiên cứu của Sinha và cộng sự 2002 [30], với 30% các mẫu khiếm thực nghiên cứu bị nhiễm độc tố gây hại thận ochratoxin.
• Loài A. fumigatus phân lập được ở tỷ lệ xếp thứ 3 (chỉ số có mặt là 50%, chỉ số có nhiều là 11%). Đây là loài nấm của chi Aspergillus có khả năng gây bệnh cơ hội phổ biến nhất trên người, cần được lưu ý kiểm soát [32].
• Các loài A. terreus, A. parasiticus, A. tamarii và A. ustus có tỷ lệ chủng phân lập được lần lượt là 7,85; 4,71; 3,66 và 2%, cũng có khả năng sinh các độc tố patulin, citrinin, citreoviridin, aflatoxin, acid cyclopiazonic và austamid, austdiol ... [16], [24].
34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 1. Kết luận
Quá trình phân lập, phân loại nấm nhiễm trên 10 mẫu của vị thuốc mã tiền và 10 mẫu vị thuốc khiếm thực, chúng tôi rút ra một số kết luận sau.
1.1. Vị thuốc mã tiền
• Mười mẫu của vị thuốc mã tiền nghiên cứu, có hàm ẩm dao động từ 5,92 - 16,35% đều bị nhiễm nấm mốc với số chủng phân lập được dao động từ 4- 42 chủng/mẫu.
• Từ 10 mẫu mã tiền nghiên cứu đã phân lập được 199 chủng nấm, thuộc 6 loài của chi Aspergillus gồm A. flavus, A. niger, A. fumigatus, A. ochraceus,
A. tamarii và A. terreus.
• Loài A. niger chiếm tỷ lệ cao nhất cả về số chủng phân lập được (chỉ số có nhiều) với tỷ lệ 52,26% (104/199) và tỷ lệ xuất hiện trên các mẫu nghiên cứu (chỉ số có mặt) là 80% (8/10 mẫu nghiên cứu).
• Xếp thứ 2 là loài A. flavus có tỷ lệ số chủng phân lập được là 20,1% (40/199), và chỉ số có mặt là 60% (6/10).
• Xếp thứ 3 là loài A. fumigatus, với các chỉ số có nhiều và có mặt lần lượt là 11,06% (22/199) và 60% (6/10).
• Các loài A. tamarii, A. ochraceus và A. terreus lần lượt xếp thứ 4, thứ 5 và thứ 6 với các chỉ số có nhiều và có mặt lần lượt là: 10,05% (20/199) và 30% (3/10); 4,52% (9/199) và 50% (5/10); 2,01% (4/199) và 30% (3/10).
1.2. Vị thuốc khiếm thực
• Mười mẫu của vị thuốc khiếm thực, có hàm ẩm dao động từ 10,43 – 15,88% đều bị nhiễm nấm mốc với số chủng phân lập được dao động từ 4-73 chủng/mẫu.
35
• Từ 10 mẫu khiếm thực nghiên cứu đã phân lập được 191 chủng nấm thuộc 7 loài của chi Aspergillus gồm A. flavus, A. parasiticus, A. niger, A. fumigatus, A. tamarii, A. terreus và A. ustus.
• Loài A. flavus chiếm tỷ lệ cao nhất về số chủng phân lập được, với tỷ lệ
36,65% (70/191) và tỷ lệ có mặt loài trên các mẫu nghiên cứu là 40% (4/10 mẫu nghiên cứu).
• Loài A. niger xếp vị trí thứ 2, có tỷ lệ số chủng phân lập được là 34,03% (65/191) và chỉ số có mặt là 80% (8/10 mẫu nghiên cứu).
• Xếp thứ 3 là loài A. fumigatus, với các chỉ số có nhiều và có mặt lần lượt là 10,99% (21/191) và 50% (5/10).
• Xếp thứ 4, thứ 5, thứ 6 và thứ 7 lần lượt là các loài A. terreus, A. parasiticus,
A. tamarii và A. ustus với các chỉ số có nhiều và chỉ số có mặt theo thứ tự
là: 7,85% (15/191) và 40% (4/10); 4,71% (9/191) và 40% (4/10); 3,66% (7/191) và 40% (4/10); 2,09 (4/191) và 20% (2/10).
2. Đề xuất
• Tiếp tục nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc, nhất là các loài có khả năng sinh độc tố aflatoxin và ochratoxin trên 2 vị thuốc mã tiền và khiếm thực bằng việc mở rộng phạm vi nghiên cứu cả về số mẫu và vùng địa lý.
• Triển khai nghiên cứu khả năng nhiễm các độc tố aflatoxin và ochratoxin trên 2 vị thuốc này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Mai Thị Ánh (2008), Nghiên cứu khả năng sinh độc tố aflatoxin của loài Aspergillus flavus trên cơ chất hạt sen ở điều kiện phòng thí nghiệm, Khóa luận
tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
2. Bộ Y Tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 3. Trần Trịnh Công (2003), Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và khả năng
sinh aflatoxin B1 của nhóm Aspergillus flavus trên một số vị thuốc đông dược đang lưu hành trên địa bàn Hà Nội, Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học,
Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
4. Trần Trịnh Công và cộng sự (2003), Nghiên cứu mức độ nhiễm loài Aspergillus flavus và aflatoxin trên hạt sen ở một số địa điểm tại Hà Nội, Tạp
chí Dược học, Hà Nội.
5. Trần Trịnh Công và cộng sự (2005), Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và
aflatoxin trên hạt sen ở một số địa điểm thuộc các tỉnh Hà Nội, Hà Tây và Bắc Ninh, Tạp chí Y học thực hành, Hà Nội.
6. Trần Trịnh Công và cộng sự (2008), Phân lập và nghiên cứu khả năng sinh
độc tố của một số nấm mốc trên một số vị thuốc đông dược của Việt Nam, Đề
tại NCKH cấp Bộ Y tế, Hà Nội.
7. Trần Trịnh Công và cộng sự (2010), Nghiên cứu tính đa dạng loài của chi
Aspergillus Mich. ex Fr. Trên vị thuốc bách bộ đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn Hà Nội, Tạp chí thông tin Y-Dược, Hà Nội.
8. Trần Trịnh Công và cộng sự (2011), Nghiên cứu tính đa dạng loài của chi
Aspergillus Mich. ex Fr. trên 2 vị thuốc tục đoạn và thạch xương bồ đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn Hà Nội, Tạp chí nghiên cứu
9. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, tr. 529-530 và tr. 846-847, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
10. Nguyễn Thi Lý (2008), Nghiên cứu tính đa dạng loài của chi Aspergillus
và aflatoxin trên vị thuốc ý dĩ, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, Trường
Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
11. Nguyễn Thị Hoài Thu (2010), Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi Aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn Hà Nội, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học,
Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
12. Phan Thị Bích Vân (2009), Nghiên cứu đa dạng loài của chi Aspergillus
trên các vị thuốc bách bộ và hòe hoa đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn Hà Nội, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, Trường Đại
học Dược Hà Nội, Hà Nội.
Tiếng Anh
13. Ashiq S., et al. (2014), “Natrural occurrence of mycotoxins in medicinal plants: A review”, Fungal genetics and biology 66, pp.1-10.
14. Aziz N. H. et al. (1998), “Contamination of some common medicinal plant samples and spices by fungi and their mycotoxins”, Bot. Bull. Acad. Sin., Vol. 39, pp.279-285.
15. Chen A. J. et al. (2015), “Mycobiota and mycotoxins in traditional medicinal seeds from China”, Toxins 7, pp.3858-3875.
16. Didwania N. and Joshi M. (2013), “Mycotoxins: A critical review on occurrence and significance”, Int. Pharm. Pharm. Sci., Vol. 5, Issue 3, pp.
1014-1019.
17. Gautam A. K., et al. (2016), “Mycotoxins: the silent killers inside herbal drugs. A critical review of the literature”, Bio bulletin, Vol. 2(1), pp.26-39.
18. Gonzalez H. H. L. et al. (1999), “Relationship between Fusarium and Alternaria alternata contamination and deoxynivalenol occurrence on
Argentinian durum”, Mycopathologia, Vol.144, pp.97-102.
19. Pitt J.I. and Hocking A.D. (2009), “Fungi and Food Spoilage”, Academic Press.
20. Raper K.B. and Fennell D.I. (1965), “Genus Aspergillus”, Baltimo,
Williams and Wilkins, USA.
21. Rashidi M. and Deokule S. S. (2013), “Natural occurrence of fungal and aflatoxins contamination in some genuine and market herbal drugs”, Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res., Vol. 18(1), pp.121-125.
22. Rawat A. et al. (2014), “Detection of toxigenic fungi and mycotoxins in some stored medicinal plant samples”, Int. J. Appl. Sci. Biotechnol., Vol. 2(2), pp.211-216.
23. Rizzo I., et al. (2004), “Assessment of toxigenic fungi on Argentinean medicinal herbs”, Microbiological Research 159, pp.113-120.
24. Samson R. A. et al. (1995), “Introduction to food-borne fungi”, Fourth edition, CBS press.
25. Santos L. et al. (2013), “Mycotoxin in medical/aromatic herbs – a review”,
Boletín Latinoamericano y del Caribe de plants medicales y aromáticas 12(2),
pp.119-142.
26. Sareen A. et al. (2010), “Fungal contamination of some common medicinal plant samples of Himachal Pradesh”, Sci. & Cult. 76 (3-4), pp.118-120.
27. Sharma S. et al. (2016), “Natural occurrence of diverse fungal species and their toxin in dried fruits of Emblica officinalis, Terminalia chebula and T. bellerica – constituents of triphala, an important Ayurvedic preparation of
India”, IOSR journal of pharmacy and biological sciences, Vol. 11, Iss. 1,
28. Sharma et al. (2013), “Investigation on the mycoflora and mycotoxin contamination of dried medicinal leaves of Azadirachta indica A. Juss., and Justicia adhatoda Linn., from Jammu and Kashmir state (India)”, International Journal of advanced research, Vol. 1, Iss. 4, pp.131-138.
29. Siddique N. A. et al. (2013), “Determination of aflatoxins in medicinal plants by high-performance liquid chromatography - tandem mass spectometry”, J. Pharam. Sci., Vol. 16(2), pp.321-330.
30. Sinha B. K. et al. (2002), “Mycotoxins, mycotoxigenic fungi and the biochemical changes in makhana (Euryale ferox Salisb) puffs of North Bihar”,
Journal of food science and technologry (Mysore), Vol. 39, No. 1, pages 38-
41.
31. Tosun H. et al. (2016), “Occurrence of aflatoxins (B1, B2, G1, G2) in herbal tea consumed in Turkey”, Journal of consumer protection and food safety,
pp.1-5.
32. Walsh T. J., et al. (2008), “Treatment of aspergillosis: clinical practice