3.1. Nguyên liệu, dụng cụ và hố chất. 3.1.1. Nguyên liệu: 3.1.1. Nguyên liệu:
Nguyên liệu dùng để nghiên cứu là đậu nành. Nguồn nguyên liệu này được mua cố định tại một điểm ở chợ Phạm Văn Hai (F.3, Quận Tân Bình).
Đậu nành cĩ màu vàng, hình oval. Các hạt cĩ kích thước đều nhau và khơng cĩ tạp chất, hư mốc.
Nguyên liệu tiếp theo là các loại enzyme: Alcalase 2.4LFG, Flavourzyme 500MG, Viscozyme L và các hố chất cần thiết như: HCl, Na2CO3, phẩm màu, hương liệu… được mua ở chợ Kim Biên.
3.1.2. Dụng cụ và hố chất a. Dụng cụ a. Dụng cụ
Dụng cụ, thiết bị Số lượng
Máy nghiền 1 cái
Nồi hấp 1 cái
Thiết bị thuỷ phân enzyme bằng inox 2 vỏ, cĩ cánh khuấy và cảm biến nhiệt
1 cái Các dụng cụ sản xuất
khác như: nhiệt kế, máy đo pH, thau, xơ…
Yêu cầu Các dụng cụ phân tích
như: máy chưng cất đạm, erlen, burette, pipette...
Yêu cầu
b. Hố chất
– Các hố chất vơ cơ: HCl 30%, Na2CO3 30%, NaOH đặc, H2SO4… – Các chất phụ gia, hỗ trợ kỹ thuật: Natribenzoat (C7H5NaO2), muối tinh khiết, màu caramen, hương liệu.
http://www.ebook.edu.vn
3.2. Phương pháp nghiên cứu
Việc lựa chọn phương pháp nghiên cứu này cho phép ta cĩ thể hiểu rõ về quy trình sản xuất nước tương bằng phương pháp kết hợp. Cách bố trí các thí nghiệm của tơi tập trung chủ yếu vào việc nghiên cứu và tìm hiểu về sự biến đổi của nguyên liệu trong các quá trình thuỷ phân, đồng thời xác định được tỷ lệ của tác nhân xúc tác. 3.2.1. Sơđồ thực hiện a. Quy trình dự kiến thực hiện: Đậu nành Nghiền nhỏ, Hấp chín Thuỷ phân 3 Lọc Phối chế Lắng tự nhiên Lọc tinh Nước tương Thuỷ phân 1 Alcalase Viscozyme Thuỷ phân 2 Flavourzyme HCl 30% Trung hồ Na2CO3 30%
b. Giải thích quy trình
Ở quy trình trên, các giai đoạn thuỷ phân là quan trọng nhất và là tâm điểm của đề tài. Do vậy chỉ xin giải thích các cơng đoạn trên.
Giai đoạn Thuỷ phân 1:
Mục đích và cách thực hiện:
– Mục đích của quá trình này là phân giải protein thành các acid amin. – Hỗn hợp hai enzyme này sẽ thuỷ phân các hợp chất cao phân tử cĩ trong nguyên liệu ban đầu thành các hợp chất trung gian cĩ phân tử nhỏ.
– Hỗn hợp enzyme này sẽ được đưa vào bồn thuỷ phân, trong bồn cĩ chứa dịch huyền phù của đậu nành. Dưới tác dụng của cánh khuấy, hỗn hợp enzyme này sẽ được trộn đều cùng với nguyên liệu, từ đĩ enzyme tiếp xúc trực tiếp với cơ chất và thực hiện vai trị xúc tác thuỷ phân các chuỗi phân tử cĩ trong nguyên liệu.
Biến đổi:
– Bột đậu nành sau khi hydrat hĩa và xử lý nhiệt được làm nguội đến nhiệt độ thích hợp, bổ sung enzyme Alcalase và Viscozyme vào, giữ hỗn hợp ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian cần thiết để tạo điều kiện cho hai enzyme hoạt động thủy phân hỗn hợp.
– Ở giai đoạn này pH của dung dịch bị thay đổi, giảm xuống 1 đơn vị. – Nhiệt độ của quá trình phải luơn ổn định từ 50 - 550C, và thời gian thực hiện giai đoạn này kéo dài khoảng 40 - 50 phút.
– Alcalase sẽ thủy phân protein đến mức độ nhất định tạo điều kiện cho enzyme Flavourzyme hoạt động thủy phân sau này. Dưới tác dụng của enzyme này, cĩ thể tạo ra một số chuỗi peptid gây đắng. Các chuỗi peptid này sẽ được Flavourzyme xử lý ở giai đoạn thuỷ phân 2.
– Viscozyme cĩ nhiệm vụ thủy phân các mạch glucan, xylan, hemicellulose, cellulose. Chính vì vậy mà nĩ sẽ tăng khả năng thâm nhập của Alcalase và Flavourzyme, do đĩ sẽ tăng khả năng thủy phân protein.
http://www.ebook.edu.vn
Quá trình thủy phân này cịn hỗ trợ cho cả quá trình lọc sau này. Giai đoạn thuỷ phân 2
Mục đích và cách thực hiện:
– Mục đích của quá trình là tiếp tục thuỷ phân các sản phẩm trung gian từ giai đoạn trên thành đạm acid amin.
– Trước khi sử dụng cần chuẩn bị dung dịch enzyme Flavourzyme. Bổ sung enzyme vào với lượng thích hợp và ủ hỗn hợp ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian cần thiết để enzyme hoạt động
Biến đổi:
– Flavourzyme sẽ tiếp tục thủy phân các peptid được tạo ra ở giai đoạn thủy phân 1 và tiếp tục thủy phân protein thành các aminoacid và các peptid ngắn mạch.
– Khơng chỉ thuỷ phân các protein cịn lại trong dịch mà đồng thời cịn tạo hương cho sản phẩm thủy phân sau này. Trong quá trình này cần khuấy đều hỗn hợp để quá trình thủy phân dễ dàng hơn.
– Bên cạnh đĩ Flavourzyme cũng chứa amylase và carbohydrase khác, nên sẽ thủy phân các tinh bột thành saccharides và carbohydrate hịa tan. Vì vậy mà mùi vị của hỗn hợp sẽ được biến đổi rõ rệt theo hướng cĩ lợi. Giai đoạn thuỷ phân 3
Mục đích và cách thực hiện:
– Quá trình này nhằm thu được tối đa hàm lượng acid amin cĩ trong nguyên liệu ban đầu.
– Thơng thường mức độ thủy phân khi sử dụng enzyme chỉ đạt tối đa khoảng 60 đến 70%. Do đĩ mà thủy phân tiếp tục bằng acid với lượng thích hợp sẽ tăng hiệu suất thủy phân đáng kể, cĩ thể đạt tới 90%.
– Quá trình cho acid vào cần thận trọng khuấy đều hỗn hợp, cho acid một cách từ từ để giúp hỗn hợp thấm đều acid, tránh hiện tượng chất nền
bám vào đáy thiết bị thủy phân. Biến đổi:
– Quá trình gia nhiệt trong giai đoạn thủy phân bằng acid sẽ làm tăng khả năng thủy phân, giảm thời gian thủy phân cần thiết.
– Tuy nhiên, việc này sẽ làm tăng mối nguy 3-MCPD. Do đĩ mà cần giới hạn nhiệt độ thủy phân cũng như tốc độ gia nhiệt. Lượng acid dùng thủy phân càng nhiều thì hiệu suất thủy phân càng lớn. Nhưng lượng acid cho vào nhiều cĩ thể làm 3-MCPD vượt giới hạn cho phép.
– Kiểm sốt chặt chẽ nhiệt độ, áp suất và thời gian thuỷ phân để tránh xảy ra phản ứng phân huỷ các acid amin như: deamin hố, decarboxyl hố…và dùng giấy anilin acetate để xác định điểm dừng của quá trình thuỷ phân, nếu lượng furfural thốt ra hết thì giấy khơng ngả sang màu đỏ.
– pH của dung dịch bị thay đổi rất lớn, kết thúc quá trình này pH = 2.5. Giai đoạn Trung hịa hỗn hợp thủy phân
– Hỗn hợp sau khi thủy phân bằng acid cịn dư HCl, độ pH rất thấp, ảnh hưởng đến vị của sản phẩm. Trung hịa hỗn hợp về pH acid nhẹ để tạo vị hài hịa cho sản phẩm.
– Hỗn hợp này được làm nguội, sau đĩ cho Na2CO3 vào để trung hịa hỗn hợp về pH từ 5,0 - 6,2. Khi trung hịa cần cho Na2CO3 theo từng ít và khuấy đều liên tục để tránh gây phản ứng cục bộ. Khi trung hịa bằng Na2CO3 thì CO2 bay ra sẽ làm thốt đi một số mùi khơng cần thiết.
3.2.2. Xác định tỷ lệ các tác nhân thuỷ phân
Trong quá trình thực nghiệm xác định thơng số của các tác nhân thuỷ phân, cĩ thơng số này cĩ tương quan qua lại lẫn nhau và tổng hồ các yếu tố trên ta mới cĩ thể biết được hiệu suất thuỷ phân. Do vậy, khi khảo sát một thơng số nào đĩ thì cần phải cố định các thơng số cịn lại.
http://www.ebook.edu.vn
a. Xác định tỷ lệ Alcalase và Viscozyme
Tỷ lệ Alcalase:
– Để xác định các thơng số cho quá trình thuỷ phân 1, tơi cố định nhiệt độ thuỷ phân là 550C. Theo một số tài liệu thì nhiệt độ tối ưu để các enzyme hoạt động thường < 600C, do vậy khi khảo sát Alcalase tơi chọn ngưỡng thấp trong khoảng nhiệt độ tối ưu của enzyme này.
– Mỗi thơng số sẽ được tiến hành khảo sát trên 6 mẫu.
– Khi tiến hành xác định tỷ lệ Alcalase, tơi cố định các yếu tố như: thời gian thuỷ phân là 50phút và tỷ lệ Viscozyme là 0,15%/kg Pro.
– Dựa vào hoạt độ của enzyme và liều lượng sử dụng (thể hiện ở bảng 2.13), tơi chọn khoảng dao động của 6 mẫu được khảo sát như sau:
Tỷ lệ Viscozyme
– Tiến hành khảo sát tương tự như trên, tỷ lệ Alcalase chọn cố định là 0,8%/kg pro. Các thơng số nhiệt độ và thời gian khơng thay đổi.
– Theo như tài liệu thì mục đích sử dụng enzyme này là để thuỷ phân lớp vỏ và thành tế bào để cho hai enzyme cịn lại dễ thâm nhập và thực hiện quá trình. Do vậy tơi chọn khoảng dao động của 6 mẫu được khảo sát như sau: (tăng gấp đơi so với số liệu bảng 2.13)
Mẫu 1: 0,5% Mẫu 2: 0,6% Mẫu 3: 0,7% Mẫu 4: 0,8% Mẫu 5: 0,9% Mẫu 6: 1% Phân tích kết quả: Hàm lượng Ntq, Naa và NNH3 Mẫu 1: 0,1% Mẫu 2: 0,11% Mẫu 3: 0,12% Mẫu 4: 0,13% Mẫu 5: 0,14% Mẫu 6: 0,15% Phân tích kết quả: Cảm quan và khả năng lọc
Xác định thời gian thuỷ phân:
– Đây là một yếu tố quan trọng trong quá trình thuỷ phân.
– Để xác định yếu tố trên, chọn cố định các thơng số của quá trình như sau: tỷ lệ Alcalase là 0,8%; tỷ lệ Viscozyme là 0,15% và nhiệt độ là 550C.
– Khi đưa enzyme vào thuỷ phân, chúng cần một khoảng thời gian từ 20 - 30phút trải qua giai đoạn ủ rồi mới hoạt động. Vì vậy khoảng thời gian khảo sát được tiến hành sát với 6 mẫu như sau:
b. Xác định tỷ lệ Flavourzyme
Tỷ lệ Flavourzyme:
– Cũng tiến hành khảo sát lần lượt tương tự như quá trình thuỷ phân 1. Nhiệt độ thuỷ phân vẫn giữ ở 550C khơng thay đổi, chọn cố định thời gian thuỷ phân là 16 giờ. Ở giai đoạn này, việc thuỷ phân của flavourzyme là phân huỷ các hợp chất phân tử nhỏ thành acid amin và các hợp chất khác tạo nên hương vị, do vậy mà cần kéo dài thời gian.
– Do quá trình này kéo dài nên tơi chọn tỷ lệ khảo sát cao. Tiến hành khảo sát trên 6 mẫu như sau:
Mẫu 1: 30 phút Mẫu 2: 40 phút Mẫu 3: 50 phút Mẫu 4: 60 phút Mẫu 5: 70 phút Mẫu 6: 80 phút Phân tích kết quả: Hàm lượng Ntq, Naa, NNH3 và tính chất cảm quan Mẫu 1: 1% Mẫu 2: 2% Mẫu 3: 3% Mẫu 4: 4% Mẫu 5: 5% Mẫu 6: 6% Phân tích kết quả: Hàm lượng Ntq, Naa và NNH3
http://www.ebook.edu.vn Xác định thời gian thuỷ phân:
– Khoảng thời gian tơi chọn để khảo sát ở trên là do khi quá trình thuỷ phân 2 bắt đầu thì quá trình 1 vẫn cịn tiếp diễn và kéo dài thêm khoảng 6giờ.
– Cũng tiến hành khảo sát trên 6 mẫu, cố định nhiệt độ thuỷ phân là 550C và tỷ lệ enzyme là 3%/kg pro.
c. Xác định tỷ lệ HCl 30%
Tỷ lệ HCl 30%
– Để xác định yếu tố này, chọn cố định nhiệt độ thuỷ phân là 1200C (thơng số tham khảo) và thời gian thực hiện quá trình này là 10 giờ. Thời gian kéo dài nhằm mục đích để tác nhân thuỷ phân triệt để các thành phần cịn lại. Ở nhiệt độ cao và nồng độ cao thì quá trình thuỷ phân của acid sẽ diễn ra nhanh.
– Xác định tỷ lệ tiến hành khảo sát 6 mẫu như sau: (tỷ lệ HCl so với dịch thuỷ phân 2, (V:V)) Mẫu 1: 10giờ Mẫu 2: 12giờ Mẫu 3: 14giờ Mẫu 4: 16giờ Mẫu 5: 18giờ Mẫu 6: 20giờ Phân tích kết quả: Hàm lượng Ntq, Naa và NNH3 Mẫu 1: tỷ lệ 1:1 Mẫu 2: 1:2 Mẫu 3: 1:3 Mẫu 4: 1:4 Mẫu 5: 1:5 Mẫu 6: 1:6 Phân tích kết quả: Hàm lượng Ntq, Naa và NNH3 Các tính chất cảm quan
Xác định thời gian thuỷ phân
– Cố định nhiệt độ thuỷ phân là 1200C và tỷ lệ HCl 30% là 1: 6 so với nguyên liệu.
– Khảo sát 6 mẫu thuỷ phân như sau:
Xác định nhiệt độ thuỷ phân
– Cố định yếu tố thời gian là 10 giờ và tỷ lệ HCl 30% cho quá trình thuỷ phân là 1:6.
– Khảo sát 6 mẫu thử:
d. Xác định tỷ lệ phối chế các thành phần phụ gia
– Sau quá trình thuỷ phân, thu được bán thành phẩm là nước tương thơ. Bước tiếp theo là phải phối trộn một số các thành phần phụ gia để tạo hương vị và màu sắc cho sản phẩm.
– Các thành phần bổ sung là: muối, bột ngọt (nếu chưa đạt mong muốn), màu, hương mazzi và các chất bảo quản.
Mẫu 1: 1000C Mẫu 2: 1100C Mẫu 3: 1200C Mẫu 4: 1300C Mẫu 5: 1400C Mẫu 6: 1500C Phân tích kết quả: Hàm lượng Ntq, Naa và NNH3 Các tính chất cảm quan Mẫu 1: 8giờ Mẫu 2: 9giờ Mẫu 3: 10giờ Mẫu 4: 11giờ Mẫu 5: 12giờ Mẫu 6: 13 Phân tích kết quả: Hàm lượng Ntq, Naa và NNH3 Các tính chất cảm quan
http://www.ebook.edu.vn
– Tham khảo tài liệu (dựa trên TCVN 1763-75 và Danh mục quy định sử dụng phụ gia-3742 BYT) tơi chọn tỷ lệ phối chế các thành phần như sau:
Phối chế vị:
Bảng 2.3. Tỷ lệ muối và bột ngọt bổ sung vào bán thành phẩm (g/l)
Mẫu 1 2 3 4 5 6
Muối 150 160 170 190 200 210 Bột ngọt 10 12 14 16 18 20
Phối chế màu caramen, hương mazzi và chất bảo quản:
Bảng 2.3. Tỷ lệ caramen, hương mazzi và chất bảo quản bổ sung vào bán thành phẩm Mẫu 1 2 3 4 5 6 Caramen (g/l) 1 2 3 4 5 6 Hương mazzi (ml/l) 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 Natrbenzoat (%/l) 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 3.2.3. Phương pháp phân tích
a. Xác định đạm tổng quát (Ntq) bằng phương pháp Kjeldahl. b. Xác định đạm Amoniac (NNH3)
Nguyên lý
Dùng một kiềm mạnh hơn NH3 để đẩy NH3 ra khỏi thực phẩm (nhưng khơng quá mạnh, thường dùng Mg(OH)2). Dùng hơi nước để lơi cuốn NH3 vào cốc hứng chứa H2SO4 0,1N tiêu chuẩn, dư. Cuối cùng dùng NaOH để chuẩn độ lại H2SO4 dư.
2 NH4Cl + Mg(OH)2 = 2 NH3 + 2H2O + MgCl2 2NH3 + H2SO4 = ( NH4)2SO4
NaOH + H2SO4 dư = Na2SO4 + 2H2O
Dụng cụ
– Bình cầu chứa mẫu
– Thiết bị chưng cất đạm đơn giản – Đèn cồn.
– Các dụng cụ thơng thường khác của phịng thí nghiệm: Buret, pipet, cốc thủy tinh...
Hĩa chất, vật liệu
– Dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N – Dung dịch chuẩn NaOH 0,1N – Chỉ thị màu Methyl đỏ 0,1% – Chỉ thị Phenolphtalein 1% – Giấy thử pH – MgO – Nước cất Cách tiến hành Gồm các bước
– Chuẩn bị mẫu và Chuẩn bị cốc hứng: Giống như phần chuẩn bị cốc hứng khi xác định đạm tổng quát.
– Chưng cất: Cho mẫu đã chuẩn bị vào bình cầu chứa mẫu, thêm nước cất vào để quá trình chưng cất khơng bị cạn. Cho thêm vài giọt Phenolphtalein 1% vào, cho dung dịch Mg(OH)2 bão hịa vào cho tới khi cĩ màu hồng, đậy nắp và tiến hành chưng cất. Chưng cất tới khi thử dung dịch chảy ra ở đầu ống sinh hàn cĩ pH=7.
– Chuẩn độ: Lấy cốc hứng ra và chuẩn độ lại H2SO4dư bằng NaOH 0,1N chuẩn đến khi dung dịch chuyển từ đỏ sang vàng nhạt.
http://www.ebook.edu.vn Tính kết quả:
Mẫu lỏng:
Mẫu rắn: Trong đĩ:
A(ml) : Thể tích H2SO4 0,1N tiêu chuẩn đã dùng B(ml) : Thể tích NaOH 0,1N tiêu chuẩn tiêu tốn F : Hệ số pha lỗng mẫu
V (ml) : Thể tích mẫu đem đi xác định
0,0014: Số g nitơ tương đương với một ml H2SO4 0,1N P (g) : khối lượng mẫu rắn.
c. Định lượng nitơ formol (Nf) theo phương pháp Sorensen
Nguyên lý
Trong dung dịch nước các acid amin trung tính vì trong phân tử của nĩ cĩ cùng một lúc hai nhĩm chức là cacboxyl (-COOH) và nhĩm amin (NH2), cả hai nhĩm chức này đều kém điện ly.
Khi cho formol vào dung dịch acid amin thì formol sẽ tác dụng với nhĩm amin (-NH2) của acid amin và khĩa nhĩm này lại khi đĩ nhĩm (-COOH) thể hiện rõ tính acid. Sau đĩ dùng một dung dịch kiềm chuẩn để định lượng acid hình thành, từ lượng kiềm tiêu tốn xác định được hàm lượng nitơ acid amin.
Tuy nhiên trong các dung dịch thực phẩm thường tồn tại các hợp chất muối amoni nên khi cho formol vào tác dụng với acid amin tạo ra acid thì các muối này cũng phản ứng tạo thành HCl làm tiêu tốn một lượng kiềm:
NH4Cl + 6HCHO = (CH2)6N4+ 6H2O + 4HCl (A - B)*0,0014*F*1000 Ntq = (gN/l) V (A - B)*0,0014*100 Ntq = (%) P
Phương trình phản ứng:
Dụng cụ
Các dụng cụ thơng thường của phịng thí nghiệm: cốc thủy tinh, bình