III. Thăm dò tác dụng sinh học
1. Nguyên tắc thử
Dựa trên sự khuếch tán của chất thử vào môi trường dinh dưỡng có chứa vi sinh vật kiểm định. Nếu chất thử có tác dụng sẽ tạo ra các vòng vô khuẩn tỷ lệ thuận với Logarit nồng độ tương ứng.
2. M ôi trường.
Môi trường chúng tôi sử dụng gồm có:
* Môi trường canh thang * Môi trường thạch thường * Môi trường Sabouraud
3. Sinh vật kiểm định.
* 4 chủng gram (+)
Bacillus pum ilus NCTC 8241
Bacillus Cereus ATCC 9946
Staphylococcus aureus ATCC 12228
Bacilus Subtilis ATCC 6633
* 5 chủng gram (-)
Salmonella typhi VDT
Escherichia Coli 0119814
Shi gella flexn eri VDT
Proteus mirabilis 108
Pseudomonas aeruginosa VM
* Chủng nấm Candida albicans ATCC 10231
Các vi sinh vật trên chúng tôi nhận được từ Viện kiểm nghiệm, Viện dịch tễ và Viện mắt thuộc Bộ y tế.
4. Chuẩn bị mẫu thử
Các chất thử được pha ơ nồng độ 0,4% trong DMF. Sau đó các mẫu thử được tẩm vào các khoanh giấy đã diệt trùng bão hoà, bốc hơi, cách thuỷ cho đến bay hết dung môi rồi đặt vào các đĩa môi trường đã có vi khuẩn.
5. Cách tiến hành
- Pha các môi trường dinh dưỡng theo yêu cầu.
- Đem môi trường dinh dưỡng hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 117-118°c trong 30 phút. Sau đó lấy ra để nguội đến 45-60°C đem câý các vi sinh vật kiểm định ở môi trường thạch thường và môi trường Sabouraud đặc sau khi đã cấy
vi khuẩn kiểm định đem lắc đều và đổ vào các hộp petri có đường kính như nhau.
Để cho thạch đông, đem đặt các khoanh giấy đã tẩm sẩn các chất cần thử vào hộp petri theo sơ đồ quy định.
Nuôi ở nhiệt đọ 37-38°C đối với vi khuẩn và 30-32°C đối với vi nấm Đọc kết quả sau 18-24 giờ
Song song cùng điều kiện làm mẫu trắng DMF, isoniazid. Các chất mà chúng tôi đem thử là:
Chất I:isonicotinoylhydrazon của camphor
Chất II:isonicotinoylhydrazon của oxypino camphon Chất III:isonicotinoylhydrazon của aldehyd cinamic Chất IV:isonicotinoylhydrazon của acid pinonic Chất V:isonicotinoylhydrazon của aceton
Chất VI:isonicotinoylhydrazon của citral Chất VII:isonicotinoylhydrazon của antipyrin Chất VIII:isonicotinoylhydrazon của pyramidon.
Bảng 3: Kết quả thử kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp được
Chủng v s v Chất thử
Đ ường kính v òn g vô khuẩn (m m ) nồng độ 4% B.pumilus NCTC 8291 B.ceveus ATCC 9946 Staph- Aureus ATCC 12228 B.Subtilis ATCC 6633 E.Coli 0119814 Shi.flexneri VDT Sal.Typhi VDT Pro.mira Bilis 108 Pseu. Aeroginosal VM Can.Albicans ATCC 10231 I 6.1 - - - - II 12.0 - 14.3 7.1 7.3 - - - 10.8 10.5 III - 7 .2 - - - - - - - - IV - - - 10.7 - - V 10.5 9.1 1 1 . 1 13.8 10.5 6 . 2 8 . 2 8 . 1 1 1 . 2 9.3 VI 9.2 - 11.3 7.6 7.8 9.1 - - - 9,2 V II 9.1 10.4 13.5 8 . 0 - - - - 11.3 V III 8 . 1 10.8 11.9 9.2 8 . 0 • - 7.1 - 8 . 2 - (-): Ký hiệu không tác dụng.
HÌNH ẢNH MINH HOẠ TÁC DỤNG KHÁNG KHUAN, k h á n g n a m c ủ a
CÁC CHAT TỔNG HỢP Được
Anh 1: Tác dụng kháng khuẩn của hydraron của Rimiíòn trên chủng Staphylococus aureus ATCC 12228
Ảnh 2: Tác dụng kháng khuẩn của hydraron của Rimiíon tren chủng Bacillus Pumilus NCTC 8241
Ảnh 3: Tác dụng kháng khuẩn của hydraron của Rimifon trên chủng E.Coli 0119814
Ảnh 4: Tác dụng kháng Kttũ&úcủa hydraron của Rimiíon trên chủng nấm Candida albicans ATCC 10231
Nhận xét về tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các hợp chất chúng tôi tổng hợp được;
- Chúng tôi đã tiến hành thăm dò tác dụng sinh học của 8 chất tổng hợp được với 4 chủng gram(+), 5 chủng gram (-) và 1 chủng nấm. Kết quả thu được
cho chúng tôi nhận xét như sau
a) Tác dụng kháng khuẩn
+ isonicotinoylhydrazon của camphor (chất I), của aldehyd cinamic (chất III) của acid pinonic (chất IV) chỉ có tác dụng trên một chủng vi sinh vật kiểm định
+ Các chất II, VI, VII, VIII tác dụng tốt với vi khuẩn gram(+) và với vi khuẩn gram(-) là E.coli
+ Chât có tác dụng tốt nhất với cả loại vi khuẩn đem thử là chất V (isonicotinoylhydrazon của aceton)
b) Tác dụng kháng nấm
+ Trong số 8 chất đem thử với một loại nấm candida albicans. Kết quả cho thấy có 4 chất không tác dụng đó là chất (I, III, IV, VIII), 4 chất còn lại (II, V, VI, VII) có tác dụng tốt với vi nấm đem thử.
Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm cần đi sâu hơn nghiên cứu m ột số chất có tác dụng tốt, đặc biệt là chất V (isonicotinoylhydrazon của aceton).
PHẨN III KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu thực nghiệm đã trình ở phần trên cho phép chúng tôi kết luận như sau:
1. Đã tổng hợp được 8 dẫn chất hydraron của rimifon trong đó có 5 chất chưa thấy trong các tài liệu đã tham khảo (III, V, VI, VII, VIII). Cụ thể là
- Chất III: isonicotinoylhydrazon của aldehyd cinamic - Chất V : isonicotinoylhydrazon của aceton
- Chất VI: isonicotinoylhydrazon của citral - Chất VII: isonicotinoylhydrazon của antipyrin - Chất VIII: isonicotinoylhydrazon của pyramidon.
2. Các chất tổng hợp được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy.
Cấu trúc hoá học của các chất được xác định bằng phân tích phổ hồng ngoại, tử ngoại, kết quả thu được cho phép chúng tôi kết luận rằng các chất tổng hợp được có công thức đúng như dự kiến.
3. Đã thử tác dụng kháng khuẩn của 8 chất tổng hợp với 9 chủng vi khuẩn kiểm định đó là bốn chủng gram (+) và năm chủng gram (-).
Kết quả cho thấy: các chất tổng hợp được đều có tác dụng kháng khuẩn ở mức độ khác nhau, đặc biệt là chất V(isonicotinoylhydrazon của aceton) có tác dụng với tất cả 9 chủng vi khuẩn kiểm định.
4. Đã thử tác dụng kháng nấm của 8 chất tổng hợp được với chủng nấm
Candida albìcans ATCC 10231, kết quả cho thấy 4 chất (II,V,VI,VII) có tác
dụng kháng nấm ở nồng độ 4mg/ml, bốn chất còn lại (I,III,IV,VIII) không có tác dụng kháng nấm.
Do điều kiện thời gian, thiết bị, kinh phí còn hạn chế nên chúng tôi chưa tiến hành thử ngiệm các tác dụng dược lý khác.Chúng tôi mong rằng đề tài này sẽ được tiếp tục nghiên cứu kỹ hơn về tác dụng dược lý của các chất tổng hợp góp phần tìm ra các chất mới có tác dụng điều trị bệnh ở nước ta hiện nay
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Hoá hữu cơ tập I, II. Tài liệu học tập trường ĐH Dược Hà nội (1990) [2]. Hoá dược tập I, II - Tài liệu học tập trường ĐH Dược Hà nội (1998) [3]. Thực hành Dược khoa - Nhà XB Y học (1986)
[4]. Chu Thị Lộc. Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp sinh học (1999) [5]. Bộ y tế (1994) Dược điển Việt Nam II, Tập III, Nhà XB Y học Hà nội
[6 ]. Trần V iết Hùng, Nguyễn Quang Đạt, Lê Ngọc Vân, Lê Thị Tập - Nghiên cứu tác dụng của một số dẫn chất Thiosmicarbazon & isonicotinoylhydrazon của Isatin & 5- Halozen isatin, Tạp chí dược học số 8 (T15-17) (2000)
[7]. N guyễn Đình Hường (1991) “Bệnh lao” - Bách thư khoa bệnh học Tập I, TT biên soạn từ điển Bách khoa Việt nam
[8 ]. N guyễn Quang Đạt, Nguyễn Khang (1984) Nguyên lý tổng hợp thuốc hữu cơ - N hà XB Y học Hà nội
[9]. Nguyễn Khang, Trần M ạnh Bình, Phạm Gia Khôi, Nguyễn Thị Liên, Trần Thị Lý, N guyễn Thị Như Mai (1975) nghiên cứu về isonicotinoylhydrazon có tác dụng kháng vi trùng lao. Thông báo khoa học sô 22 trường ĐH Dược Hà nội trang 15-32
[10]. Lưu Thị Liên (2000) nghiên cứu kết quả điều trị bằng công thức 2SRHZ/6HE ở bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới ở quận Hai Bà Trưng - Hà nội từ năm 1996-1999 luận văn thạc sĩ y học trường ĐH Y Hà nội
[11]. Thuốc chống lao từ điển Bách khoa Dược học 1999 - Nhà XB Từ điển Bách khoa Hà nội
[12]. Phạm M inh Thuỷ, Nguyễn Quang Đạt, Nguyễn Khang (1987) Bán tổng hợp Acitpinonic & Oxypinocamphor từ tinh dầu thông & tổng hợp một số dẫn chất oxim, este, semicarbazon - Tạp chí dược học số 5/T19
[13]. Volgel - practiccal organic chemistry thirtd edition 1956. P324
[14]. “Isoniazid” M artinda/Thirty- first Edition 1996, the Roayl pharmsceltical Society PP241-243
[15]. l.D.field, s.Stemheil, J.R.Kaiman, Organic structures from Spectra second editon, John W iley & Sons Chichester Newyork brisbane Tononto Singapo [16]. K.dal Hooker, pharm D and Paul M.Jost, M.D (1993) "TuberCuiois",
Clinical Pharmacy and Therapeutics fifth edition, pp 1902-1108
[17]. GeraldL M andell and W illiam petri, Jr (1995), "Antimocobacterial agent", the pharmacological basis of therapeutics ninth edition, pp 1155-1159
[18]. The merck index eight edition 1968, Merk & Co, Inc Rahway, NJ, USA [19]. M orrison and Boyd (1987), organic chemistry fifth edition, Allyn and
Bacon, Inc, Boston London Sydney Toroto, pp 759-789, 1215-1223. 40
PHỤ LỤC
CÁC PHỔ ĐỒ HỒNG NGOẠI VÀ TỬ NGOẠI. (HÌNH 1 - 16)
P E R K IN ELM E R t
P E R K IN E L M E R 2 7 .7 1 -1 ZT 4 . 2 1 - '1 l\ V
4000 35 UŨ Z5UU ZOuO Ỉ 500 1 0 0 0
HO C O -N H -N ^
N
500 crrr1
02/03/25 08:12 Phong TNTT-DH Duoc Y: 1 scan, 4.0cm-l, flat, smooth Mau II-Thuy/HCo
P E R K IN E L M E R
P E R K IN ELM E R
2. 9 0 ---
4088 3500 3000 250
02/03/25 08:25 Phong TNTT-DH Duoc X: 1 scan, 4.0cm-l, flat, smooth Mau IV/Hco
COOH
1500 lOũu ;.
0 O CÍ1Ì" 1
PERKIN ELMER
1
4000 3500 3000 25ŨU 2000 1500 1000 500 cm4
Phổ hổng ngoại chất V
02/03/25 08:32 Phong TNTT-DH Duoc . . . '
Y: 1 scan, 4.0cm-l, flat, smooth Mau V/Hco
CH3
P E R K IN E LM E R
16 66 .1 - Ị I 1500 CO-NH-N=CH 03 1000 500 cnr1 Phổ hổng ngoại chất VI
P E R K IN E L M E R Q Ị-Ị
P E R K IN E LM E R ¡1. OS —I >::T ! C O -N H -N = CftHs i N v V - C H , /-CH, N - C H 3 l c h3 -\T V ii
a b s 1 . 0 0 0 4 2 nm 2 6 7 . 7 7 0 Phd l i rngoai c u a c h a t I
-0.0001 K „I/DF"'T"“i0r sw iV"r 2002 450.00
ABS_________________ D a s e L i n e _____ OFF P a g e 3 _____________________________________ Mil
d i s p l a y DATA
Use t h e g r a p h i c s c u r s o r , t r a c k , s l o p e _______ _________________________
ABS 0.61244 NM 270.000 j , . , , .
rh o tu ngoai cua chat II
DBS_______________ : 0.0000 -> 1.ZBB8_______ MM : 200.00 -> 450.00 Baseline Erase Uiew Re-scale Zoo m ’»flTTTTfli Label More
ADS 0 . 8 0 6 8 -> B.O0BB B a s e l i n e E r a s e U i e u B e - s c a l e Zoom Use t h e g r a p h i c s c u r s o r , t r a c k , s l o p e _____ MM ursbr L a b e l ZB9.BB More -> 5B8.BB ABS 2 . 0 9 2 8 0 NM 2 7 1 . I l l 0 . 0 0 0 2 MauIU /DFM/Tha i - H c o G a i n 100 SBU
Pho tir ngoai cua chatIV
450.00
ZG Mar Z002 Z . 0
2 0 0 .GO 3 0 0 . 0 0 4 0 0 . 0 0
ADS_______________ : 0.0000 -> 3.8008______ Mt1 : ZOO .80__ ->__450.00 Baseline Erase Uieu Re-scale Zo o m Label More
0 .0 0 B 1 s r ; “ T“ s UU ¡ y - ™ 2 4 5 0 . 0 0
nUS__________________ B a s e 1 i n e _____ OFF P a g e 3______________________________________MM
DISPLAY DATA
Use t h e g r a p h i c s c u r s o r , t r a c k , s l o p e
ABS 1.312 75 NM 268.889
Pho tir ngoai cüa chat VI
ry Q f - p £7 MauUI /DFM/TJi ai- Hco Z6 Mar Z002 ¿ i r Q Q Q
£ . U O . L i ~ J > G a i n 100 SBU 2 . 0 a - ü ö • O O
ABS_________________ B a s e l i n e OFF P a g e 3____________________________ __________MM.
DISPLAY DATA
ABS_______________ :__0 .00HB -> 2.Ü0OÜ_______ M M ___ : 2 0 0 . 0 0 - >__ 4 5 0 . 0 0
Baseline Erase Uieu Be-sea Ik Zoom .»lUVMii Label More
Use the graphics cursor, track, slope _____________________________________________
c h 3
VBS 1 . 0 6 8 5 1 NM 2 6 6 . 3 8 9 ,
i Ỉ1Ô tử ngoai của chấi VII
0.0001
mis__________
MauUII /DFH/'Diai-i IC O 26 Mar 2602
G a i n Í00 SillJ z.o
Base 1 hte______ OFF Page___ 3____________
450.00 ____________ MM 0 -loi’ui V DATA CfiHs I N ^ - C H , -C H , Use t h e g r a p h i c s c u r s o r , t r a c k , s l o p e
ABS 0 . 9 2 0 7 0 NM 268.88 9 P|1(5 tử ngoại của chất VIII
0.0001 MauUIII/DIUVHco G a i n 160 SLiU
26 Mnr 2002
ZM
M3S .Baseline. OFF___ Pr.iqc ___ 3_
4 b 0 .00 ____________ MIL DISPLAY Bi'iTlI 1 .6 0 0 0 1 .2 0 0 0 - B.80H0- 0 .4 0 0 0 . fj. 00(30 r \ \ yj C*H, Ị > C O - N M - N = ^ N sN -C H , y-J-GH, N -C H , CH j uu_r—;---1-—-—-— T—--- ---1--- —--- - i --- 2 0 0 .0 0 30Ừ. tJ0 4 0 0 .0 3 MSftps_______ _______ J__ 0 .0H£)B ______________ J__ 0 .0 0 0 0 -> - > __ 1.ÒB0B_______ 1 .6 0 0 0_________ NM_____rill : :__ ZBO.BB2 0 0 .0 0 -> 4 5 9 .0 0
Baseline Erase Uiew Jle-scale Zoom 5TẸ3 ÌH L a b e l More Use the graphics cursor, track, slope____________________