I/ MỤC TIÊU:
1. Khảo sát tính hòa tan của Lipid trong các dung môi khác nhau 2. Nắm được tính chất hóa học của amino acid, protein
3. Hiểu rõ và tiến hành được phương pháp định lượng protein, creatinine
II. THỰC HÀNH:
1. Thí nghiệm 1:Định lượng triglyceride huyết thanh
a. Nguyên tắc:
• Thủy phân Triglyceride bằng enzyme, xác đingj glycerol được giải phóng bằng phương pháp so màu:
Triglyceride + 3H2O Glycerol + 3R-COOH Glycerol + ATP Glycerol-3-Phosphate + ADP
Glycerol-3-Phosphate Dihydroxyacetone Phosphate + H2O2
2H2O2 + 4-amoniantipyrin + phenol Đỏ quinone + 4H2O • Thành phần các lipoprotein máu:
Lipoprotein Phân đoạn Lipid Phân đoạnprotein Cholesterol Triglycerid Phospholipid
apolipoprotein
Chylomicron 5% 90% 3% 2%
VLDL 15% 60% 15% 10%
LDL 45% 10% 20% 25% (98% Apo B)
HDL 17% 8% 25% 50%(67% Apo
A1, 22% Apo A2)
Lipoprotein lipase
Glycerol kynase Glycerol-3-Phosphate
Oxydase
• VLDL: Lipoprotein có tỷ trọng rất thấp [Very Low Density Lipoprotein] • LDL: Lipoprotein có tỷ trọng thấp [Low Density Lipoprotein]
• HDL: Lipoprotein có tỷ trọng cao [High Density Lipoprotein] b. Tiến hành:
• Trong ống nghiệm cho vào: o Thuốc thử: 500 µl o Huyết thanh: 5 µl
• Trộn đều và đọc giá trị sau khi ủ 5 phút c. Kết quả và bàn luận:
Lượng triglycerid: 132.1 (mg/DL) x 0.0114 = 1.50594 (mmol/l)
Lượng Trigyceride cao hơn so với lượng Triglycerid bình thường
d. Nhận định kết quả:
Loại mỡ trong máu Trị số bình thường Trị số không tốt gây hại cho sức khỏe
Cholesterol toàn phần <200 mg/dL (<5,2 mmol/L) (>6,2 mmol/L)>240 mg/dL LDL – Cholesterol <130 mg/dL (<3,3 mmol/L) (>4,1 mmol/L)>160 mg/dL Triglyceride <160 mg/dL (<2,2 mmol/L) >200md/dL (2,3 mmol/L) HDL – Cholesterol >50 mg/dL >1,3 mmol/L) <40 mg/dL (<1 mmol/L) • Bình thường: Triglyceride < 2,2 mmol/L
• 40 – 165 mg/dL; 0,50 – 1,30 g/L (0,57 – 1,5 mmol/L) ở nam • 0,40 – 1,1 g/L (0,46 – 1,3 mmol/L) ở nữ
• Cách đổi đơn vị:
o g/L x 1,143 = mmol/L o mmol/L x 0,875 = g/L
• Sự thay đổi nồng độ triglyceride máu phản ánh sự thay đổi của lipoprotein chứa nhiềutriglyceride, tức là VLDL và chylomicron
• Cholesterol toàn phần và triglyceride là hai thông số chủ yếu bước đầu để thăm dò một cách cóhệ thống bilan lipid, phát hiện xơ vữa động mạch
• Khi kết quả của hai thông số trên vượt ra khỏi trị số bình thường, cần xét nghiệm tiếp HDL_C,LDL_C
• Lấy máu bệnh nhân khi đói (12 giờ sau khi ăn). Trong điều kiện này mà huyết thanh có màu sữahoặc đục chứng tỏ máu bệnh lý vàđể ý tới khả năng triglyceride máu tăng
• Triglyceride máu tăng vừa (3 – 4 mmol/L) có thể thấy trong các trường hợp sau: đái đường,cường hoặc thiểu năng tuyến thượng thận, bệnh thống phong (gút), những bệnh về gan (ứ mật,xơ gan), viêm tụy cấp và mạn, hội chứng thận hư, suy thận, Cushing
• Triglyceride máu tăng vượt qua 11,3 mmol/L có thể dẫn đến viêm tụy cấp và làm tăng thiểu năngmạch máu ngoại biên
• Cũng có khả năng tăng triglyceride sau khi dùng thuốc cordicoid kéo dài hoặc ở phụ nữ dùngthuốc tránh thai có hormon sinh dục nữ
2. Thí nghiệm 2: Định lượng Cholesterol TP trong huyết thanh
• Cholestetol là một alcol vòng 27C có nhóm –OH ở vị trí C3. Khi alcol + acid béo cholesteride
• Cơ quan tổng hợp chủ yếu là gan, thận, tinh hoàn, buồng trứng,… • Ngoại sinh cholesterol từ bên ngoài vào qua thức ăn
• Cholesterol có vai trò rất quan trọng vì nó tham gia cấu tạo nên màng TB, là nguyên liệu tổnghợp nên các hormon có bản chất steroid, và là một trong ba thành phần của dung dịch mật. Tuynhiên nồng độ Cholesterol tăng cao trong máu lại là nguyên nhân dẫn đến xơ vữa động mạch
a. Nguyên tắc:
• Cholesterol TP trong huyết thanh gồm cholesterol tự do và cholesterol este hóa. Để định lượngcholesterol TP, trước hết phải dùng phản ứng thủy phân cắt đứt liên kết este, biến cholesteroleste thành cholesterol tự do
• Cholesterol este + H2O cholesterol tự do + acid béo • Cholesterol tự do + O2 Cholesten-4 + H2O2
• H2O2 + 4Aminoantipyrin + phenol Quinonemin + 4H2O Độ đậm màu của phức hồng cánh sen tỷ lệ thuận với nồng độ cholesterol toàn phần trong huyếtthanh và được xác định ở bước sóng 546nm bằng phép đo điểm cuối
b. Tiến hành:
• Mẫu thử: huyết thanh
• Thuốc thử: bộ kit hóa chất gồm: reagent A – cholesterol và standard – cholesterol (cholesterolmẫu có nồng độ 5,18 mmol/L)
Hóa chất Ống nghiệm, µl Ống trắng Ống chuẩn Ống mẫu Dung dịch thuốc thử 500 500 500 Nước cất 5 0 0 Dung dịch chuẩn 0 5 0 Huyết thanh 0 0 5 • Lắc đều, ủ 10 phút, 370C
• Đo máy ở bước sóng 505nm, phương pháp đo điểm cuối c. Kết quả và bàn luận:
Lượng cholesterol TP: 60.10 (mg/DL) x 0.026 = 1.5626 (mmol/l)
Cholesterol esterase
Cholesterol oxydase
Lượng cholesterol TP trong huyết thanh thắp so với trị số bình thường d. Nhận định kết quả:
Trị số bình thường: 1,5 -2,6 g/L (3,9 – 6,7 mmol/L) Chuyển đổi đơn vị:
- g/L x 2,59 = mmol/L
- mmol/L x 0,387 = g/L
- mmol/L x 387 = mg/dL
Tăng cholesterol máu khi trên 2,6 g/L
• Tăng cholesterol máu tiền phát: bệnh gia đình, thường gặp nhất trong các bệnh lipid di truyền,cholesterol máu có thể 8 – 10 g/L
• Vàng da tắt mật: trong sỏi mật (Cholesterol máu có thể đạt 4 g/L); Carcinoma ống dẫn mật, xơgan viêm tiểu quản mật
• Bệnh Von Gierke, viêm gan nhiễm độc (As)
• Bệnh thận, viêm thận mạn tăng urea trong máu; thận hư (do viêm thận mạn, huyết khối TMthận, thoái hóa dạng tinh bột, luput ban đỏ toàn thân, viêm quanh động mạch, xơ cầu thận, tiểuđường). Trong thận nhiễm mỡ cholesterol máu có thể đạt tới 5 g/L
• Bệnh tụy tạng: tiểu đường (cùng tăng với lipid, nhất là triglyceride), cắt tụy toàn phần, viêm tụymạn
• Suy tuyến giáp tiên phát hay thứ phát: cholesterol máu có thể quá 6 g/L, trong phù niêm donhược giáp, không có tuyến giáp bẩm sinh, rối loạn tổng
hợp hormon giáp bẩm sinh; cholesterolmáu tăng ít hoặc không tăng trong phù niêm do suy tuyến yên (suy tuyến giáp) trong phù niêmdo thiếu iod… • Xơ mỡ động mạch (XMĐM): các loại tăng LP máu có nguy cơ gây XMĐM
nhất đều có cholesterolmáu cao, các mảng XMĐM chứa 7 – 20 lần cholesterol hơn động mạch chủ
• Các rối loạn chuyển hóa lipid khác: vữa ĐM, mập, tích lipid,… Giảm cholesterol máu khi dưới 1,5 g/L
• Thiếu dinh dưỡng: đói, ung thư giai đoạn cuối, tăng urea máu, kém hấp thụ trong tiêu chảy mỡ,viêm trực đại tràng, cắt dạ dày, viêm tụy
• Gan bị tổn thương nặng: do hóa chất, thuốc, viêm gan
• Xơ gan, trong đó có xơ gan do nghiện rượu: nếu cholesterol máu giảm dưới 1 g/L và tỉ số CE/CTPdưới 30% thì tiền lượng xấu
• Cường giáp, tăng aldosterol, cường cận giáp,…
• Thiếu máu mạn: thiếu máu ác tính tái phát, thiếu máu tan huyết bẩm sinh, thiếu máu nhược sắcrõ
• Điều trị bằng ACTH và cortisol; điều trị hôn mê tiểu đường bằng insulin; dùng thuốc lợi tiểu
• Sốt và nhiễm khuẩn: viêm phổi, bạch hầu, thương hàn,…
• Giảm cholesterol máu tự phát: bệnh di truyền hiếm, vô beta lipoprotein 3. Thí nghiệm 3: Hóa học amino và protein
• Phản ứng của amino acid • Tác dụng với Ninhydrin
a. Nguyên tắc:
- Do tác dụng đồng thơi của 2 nhóm –COOH và –NH2, amino acid tác dụng với Ninhydrin cho phứcchất màu xanh tím
- Phản ứng dùng để phát hiện amino acid, ứng dụng quan trọng trong phương pháp sắc ký aminoacid
- Riêng proline và hydroxyproline cho với Ninhydrin phức chất màu vàng b. Tiến hành:
Cho vào ống nghiệm 0,5ml glycine; 0,5 dung dịch Ninhydrin. Lắc đều, đun cách thủy 5 phút
c. Kết quả và bàn luận:
Ban đầu khi cho Glycine và ninhydrin vào thì chưa có hiện tương . Sau khi lắc đều và đun cách thuỷ thì xuất hiện màu xanh tím.
4. Thí nghiệm 4:Phản ứng của Protein
a. Nguyên tắc:
Các peptide và protein với Cu2+ trong môi trường kiềm tạo phúc chất màu tím hồng, tương tự như phản ứng của các phân tử biure với Cu2+ trong môi trường kiềm nên gọi là phản ứng biure
b. Tiến hành: Lấy 3 ống nghiệm: Hóa chất Ống nghiệm, µl Ống trắng Ống chuẩn Ống mẫu CuSO4 1%, giọt 2 2 2 NaOH 1N, giọt 3 3 3 Lòng trắng trứng, ml 0 0.5 1.5 Nước cất, ml 2 1.5 0 c. Kết quả và bàn luận:
Khi cho CuSO4 và NaOH vào mỗi ống thì sẽ xuất hiện kết tủa màu xanh lam Cu(OH)2
CuSO4 + NaOH -> Cu(OH)2 + Na2SO4
- Ống 1 : chỉ thêm nước cất , kết tủa không tan , không đổi màu.
- Ống 2 : thêm 0,5 ml lòng trắng trứng, có xuất hiện phức chất màu tím hồng nhưng màu rất nhạt, dolượng lòng trắng trứng thêm vào ít. Các peptide và protein trong lòng trắng trứng tác dụng với Cu2+theophản ứng biure nên tạo phức chất màu tím hồng.
- Ống 3 : thêm 1,5 ml lòng trắng trứng, có xuất hiện phức chất màu tím hồng rõ ràng hơn ống 2 , do lượnglòng trắng trứng thêm vào nhiều. Các peptide và protein trong lòng trắng trứng tác dụng với Cu2+theophản ứng biure nên tạo phức chất màu tím hồng.
5. Thí nghiệm 5:Trầm hiện Protein bằng acid
a. Nguyên tắc:
Các Protein bị biến tính không thuận nghịch và trầm hiện bởi các acid như sulfosalicylic, trichloracetic, nitric acid,..
Trong ống nghiệm, cho vào 2 ml dung dịch lòng trắng trứng, thêm 0,5 ml dung dịch sulfosalicylic acid
c. Kết quả và bàn luận:
Xuất hiện kết tủa trắng đục
Giải thích:
Protein có trong lòng trắng trứng dưới tác dụng của dung dịch sulfosalicylic acid tạo kết tủa không thuận nghịch ( hay protein đã bị biến tính)
6. Thí nghiệm 6:Định lượng protein huyết thanh
a. Nguyên tắc:
- Protein tác dụng với CuSO4 trong môi trường kiềm cho phức chất màu tím hồng
- Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ Protein ở trong huyết thanh b. Tiến hành:
• Trong ống nghiệm cho vào: o Thuốc thử: 500 µl o Huyết thanh: 10 µl
• Trộn đều và đọc kết quả, bước sóng 546 nm sau 10 phút ủ c. Kết quả và bàn luận:
Lượng protein toàn phần trong huyết thanh bệnh nhân cao hơn mức bình thường (71.07 g/L)
Bệnh nhân có thể mắc các bệnh như đau tủy xương, nôn mửa nhiều, ỉa chảy nặng, mất nhiều mồ hôi khi sốt cao kéo dài, thiểu nặng vỏ thượng thận, đái tháo đường nặng …
d. Nhận định kết quả:
• Giá trị bình thường:
o Protein toàn phần huyết thanh: 46 – 82 g/L
o Trong đó Albumin = 38 – 54 g/L, globulin = 26 – 42 g/L
• Tăng trong đa u tủy xương, nôn mửa nhiều, ỉa chảy nặng, mất nhiều mồ hôi khi sốt cao kéo dài,thiểu nặng vỏ thượng thận, đái tháo đường nặng,…
• Giảm trong viêm thận cấp hoặc mạn tính, thận hư, mất nhiều protein qua đường ruột (do hấpthụ kém)
7. Thí nghiệm 8:Định lượng Ure
a. Nguyên tắc:
- Ure bị thủy phân trong nước dưới xúc tác của Urease tạo NH3 và CO2
- Sau đó ion amoni phản ứng với hypochloride và salicylate tạo hợp chất có màu xanh
- Độ hấp thụ ánh sáng của hợp chất này ở bước sóng 570 nm tỷ lệ thuận với nồng độ ure có trongmẫu
b. Tiến hành:
Chuẩn bị: • Huyết thanh • Thuốc thử
• Thuốc thử R1: đệm phosphate (pH=7), sodium salicylate, sodium nitroprusside, EDTA
• Thuốc thử R2: đệm phosphate (pH=7), hypochloride • Enzyme: urease
• Dung dịch ure chuẩn: 80mg/dL hoặc 13,3 mmol/L • Chuẩn bị thuốc thử
o Dung dịch enzyme 1A: trộn 10ml enzyme urease với 1000ml thuốc thử R1 • Lấy 2 ống nghiệm Hóa chất Ống nghiệm, µl Ống trắng Ống chuẩn Ống mẫu Dung dịch enzyme 1A 1000 1000 1000 Dung dịch chuẩn 0 10 0 Huyết thanh 0 0 10 Trộn và ủ 3 phút ở 370C Thuốc thử R2 1000 1000 1000 Trộn và ủ 5 phút ở 370C. Đo độ hấp thụ ở 578nm, đọc kết quả c. Kết quả và bàn luận:
d. Nhận định kết quả:
Ure là sản phẩm thoái hóa quan trọng nhất của Protein Bình thường: 0,2 – 0,4 g/L
Thay đổi có 2 trường hợp:
Thay đổi sinh lý: chế độ ăn và theo tuổi • Phạm vi bình thường đối với nito ure
o Nam: 8 – 24 mg/dL (2,86 – 8,57 mmol/L) o Nữ: 6 – 21 mg/dL (2,14 – 7,50 mmol/L) Thay đổi bệnh lý:
• Tăng:
o Nguyên nhân tại thận:
- Cấp tính (viêm cầu thận cấp, viêm ống thận, sốt vàng da chảy máu doxoắn khuẩn Liptospira gây nên hội chứng Gan thận cấp,…)
- Mạn tính (viêm thận mạn tính hay suy thận) o Nguyên nhân ngoài thận:
- Giảm lưu lượng máu đến thận: suy tim ứ huyết, sốc giảm thể tích,… - Ứ nước tiểu do chứng ngày tiết niệu: sỏi niệu quản, u tiền liệt tuyến,... - Tăng ure nội sinh do hủy hoại mạnh tế bào: bỏng rộng, chấn
thương,phẫu thuật lớn,… • Giảm:
o Có Thai
o Truyền nước quá nhiều o Tổn thương gan nặng