ứng RT-PCR
Cho 750 μl bệnh phẩm vào ống 1,5 ml Thêm 250 μl TRIZOL.
Giữ 5 phút ở nhiệt độ phòng .
Thêm 250 μl chlorofrom, đậy nắp chặt. Lắc ống trên máy lắc trong 15 giây.
Giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút
Hút 450500 μl sang một ống mới.
Thêm 500 μl iso propanol, trộn bằng pipet rồi giữ ở nhiệt độ
phòng 10 phút.
Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút.
Thêm 1ml ethanol 75% rồi ly tâm với tốc độ 10000 vòng/ phút
trong thời gian 5 phút.
Để khô ở nhiệt độ phòng . Cho thêm 20 60 μl nước
Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 bước)
Nguyên liệu :Kit QIAGen Onestep RT-PCR (catalog #210212) gồm:
Hỗn hợp enzyme QIAGen Onestep RTPCR (chứa Omn
iscript TMRT, Sesicript TMRTvà HotstarTaq TM DNA polymerase)
Dung dịch QIAGen Onestep RTPCR, 5X. Dung dịch Qsolution 5X
Hỗn hợp dNTP,10mM mỗi loại . Nước RNAse Free.
Chất ức chế RNAse( 40U/ μl). Ông ly tâm nhỏ vô tr ùng 0,5ml.
Pipet và đầu tip các cỡ 10,20 và 100 μl.
Máy ly tâm ống nhỏ tốc độ 13000 vòng/ phút
Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1bước)
Máy lắc vortex. Máy nhân gen .
RNA của virus kiểm tra . RNA đối chứng dương tính
Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 bước)
Primer forward và primer reverse .
Primer đặc hiệu H5N1: H5N1F và H5N1R
Chuẩn bị hỗn hợp PCR như sau :
Dung dịch 5XRT PCR 10 μl.
Dung dịch dNTPs10mM 2 μl.
Enzym hỗn hợp 2 μl.
Chất ức chế RNAse 0,25 μl.
Nước RNAse free 31,75 μl.
Nhỏ 46 μl hỗn hợp PCR vào mỗi ống PCR
Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 bước)
Thêm 1 μl. Primer H5N1F v à H5N1R vào các ống A, B,C.
Thêm 2 μl RAN ki ểm tra v ào các ống A
Thêm 2 μl RNA đối chứng H5N1 vào ống B
Thêm 2 μl nước rnase – free vào ống C
Ly tâm nhẹ để dịch tập trung xuống đáy ống