* Nuôi cấy vi khuẩn:
- Chuẩn bị 4 ống nghiệm, mỗi ống cho 9ml nước muối 2%.
- Thực hiện việc ựồng nhất mẫu: Dùng bộ ựồ giải phẫu ựã ựược khử trùng, tách lấy gan tụy của tôm ựể cân và cho vào cối sứ, dùng chày nghiền nhỏ mẫu, có thể cho thêm 1 - 2 ml nước muối 2% ựể nghiền.
- Pha loãng mẫu theo dãy số thập phân bằng cách dùng pipet vô trùng (hoặc pipetman với ựầu tip vô trùng) chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối 2%. Trộn mẫu trong ống nghiệm cho ựồng nhất bằng máy rung (vortex) hoặc dùng pipet hút ựảo dịch mẫu lên xuống 5 - 10 lần. Dung dịch mẫu này có ựộ pha loãng 10-2. Sau ựó, sử dụng cùng pipet hoặc pipetmen có cùng ựầu tip chuyển 1ml dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ hai chứa 9ml dung dịch pha loãng và thao tác tương tự ựể có dịch mẫu với ựộ pha loãng 10-3, 104, 105.
- Dùng pipet hút 0,1 ml dung dịch ựã ựược pha loãng trang trên ựĩa môi trường TCBS, mỗi hệ số pha loãng cấy trên 2 ựĩạ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 21
- Cấy xong nuôi trong tủ ấm ở nhiệt ựộ 28 Ờ 300C trong 24h
- Sau 24h, kiểm tra hình dạng, màu sắc, kắch thước và ựếm số lượng khuẩn lạc.
* Nuôi cấy thuần chủng:
- Mở ựĩa phân lập có khuẩn lạc nghi ngờ bên cạnh ngọn lửa ựèn cồn. - Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc nghi ngờ riêng rẽ.
- Cấy lên ựĩa thạch Nu Agar 2% NaCl.
- Nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt ựộ 28 - 300C trong 24h. * Phương pháp nghiên cứu hình thái vi khuẩn:
để nghiên cứu hình thái vi khuẩn, người ta dùng phương pháp nhuộm gram. Nhuộm gram tiến hành như sau:
- Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn thuần ựưa lên lam kắnh, cho thêm 1 ựến 2 giọt nước muối sinh lý vô trùng, dùng ựầu que cấy dàn mỏng.
- để mẫu tự khô ở nhiệt ựộ phòng.
- Hơ cao lam kắnh trên ngọn lửa ựèn cồn ựể cố ựịnh vi khuẩn.
- Nhỏ tiếp dung dịch 1 (tắm tinh thể) lên tiêu bản, ựể yên 30-60 giâỵ - Rửa nước nhanh, vẩy khô.
- Nhỏ dung dịch 2 (Lugol) ựể cố ựịnh trong 1 phút (tiêu bản có màu ựen). - Rửa nước nhanh, vẩy khô.
- Nhỏ dung dịch 3 (Cồn Aceton) ựể nghiêng ựầu một bên lam ựể cồn chảy qua chỗ phết vi khuẩn, nhằm tẩy màụ
- Rửa nước nhanh, vẩy khô.
- Nhỏ dung dịch 4 (Safranin) ựể cố ựịnh 1 ựến 2 phút.
- Rửa nước, ựể khô hoặc dùng giấy thấm khô, không ựược ựể xước mẫụ - Soi dưới kắnh hiển vi bằng vật kắnh dầu (ựộ phóng ựại x1000).
Dưới kắnh hiển vi ta có thể xác ựịnh ựược vi khuẩn gram âm bắt màu hồng và gram dương bắt màu xanh tắm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 22
* Phương pháp kiểm tra các ựặc ựiểm sinh hóa của vi khuẩn: - Thử ựặc ựiểm sinh hóa bằng các phản ứng sinh hóa thường:
+ Thử phản ứng lên men và ôxy hóa của vi khuẩn bằng phản ứng O/F Cấy vi khuẩn thuần vào 2 ống nghiệm có môi trường O/F (màu xanh), một ống hở và một ống kắn ựược phủ bằng dầu paraffin trên mặt dầy 1 cm. Nuôi vi khuẩn trong thời gian 18 - 24h ở nhiệt ựộ phòng, sau ựó ựọc kết quả:
Lên men: Ống hở và ống kắn có màu vàng Oxy hóa: Ống hở màu vàng, ống kắn màu xanh Không oxy hóa và lên men: Cả hai ống màu xanh. + Thử thạch sắt 3 ựường (TSI)
Cấy vi khuẩn thuần trên bề mặt thạch nghiêng môi trường TSI hoặc KIA (màu ựỏ) và từ giữa mặt thạch cấy một ựường thẳng ựứng xuống ựáỵ Nuôi cấy vi khuẩn sau 18 - 24 giờ ở nhiệt ựộ phòng, ựọc kết quả:
Chỉ lên men ựường Glucose: đáy ống màu vàng (acid - A); phần nghiêng màu ựỏ (kiềm - K) K/A (ựỏ/vàng)
Lên men cả 3 ựường glucose, lactose và sucrose: đáy và phần nghiêng ựều màu vàng (acid - A) A/A (vàng/vàng)
Lên men ựường lactose hoặc sucrose: Phần nghiêng màu vàng (acid), ựáy ống màu ựỏ (kiềm) A/K (vàng/ựỏ)
Không lên men cả 3 loại ựường: đáy và phần nghiêng màu ựỏ (kiềm) K/K (ựỏ/ựỏ)
Môi trường rạn nứt là sinh hơi đáy ống có màu ựen là sinh H2S + Phản ứng indol
Cấy vi khuẩn thuần trong nước tryptone, nuôi cấy vi khuẩn trong 24 - 48 giờ ở nhiệt ựộ phòng. Nhỏ 0,2 - 0,3 ml thuốc thử KovacỖs vào 5ml môi trường ựã nuôi cấy vi khuẩn, ựọc kết quả:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 23
Bề mặt môi trường có vòng màu ựỏ là vi khuẩn sinh indol - dương tắnh Môi trường có màu vàng là vi khuẩn không sinh indol - âm tắnh.
+ Phản ứng sinh H2S
Cấy vi khuẩn thuần trong môi trường SIM trong 24 giờ ở nhiệt ựộ phòng, xuất hiện màu ựen ở dọc ựường cấy là có phản ứng sinh H2S.
+ Phép thử khả năng chịu mặn
Chuẩn bị một dãy các dung dịch pepton với nồng ựộ muối natri clorua (NaCl) tăng dần: 0%, 2%, 6%, 8% và 10%.
Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn thuần và cấy nhẹ vào mỗi ống (bằng một vòng cấy ựầy). Ủ ở 370C trong 24 ổ 3h.
Nếu quan sát thấy ựục, chứng tỏ vi khuẩn nghi ngờ có thể phát triển với nồng ựộ muối Natri clorua có mặt trong ống ựựng nước pepton muốị
- Thử phản ứng sinh hoá bằng kắt thử API - 20 E:
Khi ựược vi khuẩn thuần, tiến hành pha loãng vi khuẩn thành dung dịch ở dạng huyền phù ựể thử phản ứng sinh hoá.
Nguyên lý
Phương pháp này dùng 21 tiêu chuẩn thử sinh hóa cho phép ựịnh tên một số loài vi khuẩn hình que, gram âm và thuộc họ Enterobacteriaceae.
Kắt thử API 20E gồm có các ống nghiệm nhỏ (microtube) trong có chứa các chất nền ựã khử nước. Trong quá trình ủ, hoạt ựộng của vi khuẩn sẽ làm chuyển màu hoặc làm ựục môi trường. Sau 24h ựọc các phản ứng ựối chiếu theo bảng kết quả ựể ựịnh tên.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 24
Chuẩn bị kit
+ Chuẩn bị hộp ủ và ựổ 5ml nước cất (hoặc nước khử khoáng) vào chỗ lõm ựể tạo hơi ẩm
Chuẩn bị mẫu
+ Kắt thử API 20E không dùng trực tiếp các mẫu bệnh phẩm
+ Thu mẫu bệnh phẩm, cấy lên môi trường chọn lọc. Sau ựó tiến hành chọn khuẩn lạc ựể nuôi thuần; sau 24 giờ nuôi cấy, lấy vi khuẩn thuần ựể pha loãng thành dịch huyền phù bằng 5ml NaCl 2%.
Chuẩn bị ủ
+ Dùng một pipet lấy dịch huyền phù vi khuẩn cho ựầy vào các ống.
OF-F OF-O
ONPG ADH LDC OCD CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA
Qui trình th kắt API 20E
1 2
3 4
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 25
+ đổ 1 lớp dầu vào các ống ADH, LDC, ODC, H2S, URE, VP và GEL ựể tạo môi trường yếm khắ.
+ Thử thêm ngoài trên 2 ống O/F
Ủ mẫu
+ Ủ các mẫu phản ứng ựó ở nhiệt ựộ 27 Ờ 290C thời gian 24 - 48h.
đọc kết quả
đọc kết quả theo bảng ựọc và dùng các thuốc thử hiển thị kết quả: + Thử TDA: Cho 1 giọt thuốc thử TDA chuyển màu nâu ựỏ là dương tắnh. + Thử IND: Cho 1 giọt thuốc thử JAMES phát triển màu hồng trong ống thử là dương tắnh.
+ Thử VP: Cho 1 giọt thuốc thử VP 1 và 1 giọt thuốc thử VP 2, ựợi ắt nhất 10 phút chuyển màu hồng hoặc ựỏ là dương tắnh. Nếu chuyển màu hồng nhẹ sau 10 phút là âm tắnh.
+ Thử NO2: Cho 1 giọt NIT 1 và 1 giọt NIT 2 vào ống GLỤ đợi sau 2 - 5 phút chuyển màu ựỏ là dương tắnh. Chuyển màu vàng có thể chúng khử ựến N2 (1 số trường hợp sinh hơi ở ựáy) cho thêm 2-3mg Zn vào ống GLỤ Sau 5 phút nếu ống chuyển lại màu vàng là phản ứng sinh khắ N2 là dương tắnh; nếu ống chuyển màu da cam ựến ựỏ là âm tắnh.
+ đối với môi trường OF: Dùng que cấy ựã ựược hơ nóng và ựể nguội, lấy vi khuẩn và chọc thẳng vào ống nghiệm chứa môi trường OF, nuôi trong tủ ấm 24 giờ và ựọc kết quả.
* Phân loại vi khuẩn:
- Theo tiêu chuẩn chung; ựi từ họ, giống ựến tiêu chuẩn ựặc trưng cho loàị - Dựa vào những ựặc ựiểm và kết quả thử phản ứng sinh hoá, phân loại vi khuẩn dựa vào bảng phân loại vi khuẩn, cẩm nang phân loại vi khuẩn của Frerichs (1984) và Buller (2004).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 26
* định lượng vi khuẩn:
- Dựa theo phương pháp ựịnh lượng vi khuẩn (ựếm số khuẩn lạc trực tiếp trên môi trường nuôi cấy) của Millar và Frerichs (1993).
- Tắnh số lượng vi khuẩn trong 1 gam tổ chức theo công thức dưới ựây:
Trong ựó:
A: Số khuẩn lạc mọc trên một ựơn vị thể tắch (kl/ml)
X: Số khuẩn lạc trung bình mọc trên ựĩa môi trưòng khi cấy ở một hệ số pha loãng. V: Thể tắch mẫu ựã dùng ựể cấy (ml) K: Hệ số pha loãng * Xác ựịnh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Trong ựó:
X (%): Tỷ lệ phần trăm tôm bị nhiễm. A: Số mẫu tôm bị nhiễm.
B: Số mẫu tôm kiểm trạ
Ghi chú: Tất cả các thao tác ựược thực hiện trong ựiều kiện vô trùng. 2.4. Phương pháp phân tắch và xử lý số liệu
Số liệu ựược xử lý thống kê bằng phần mềm Exell. Sử dụng phương pháp phân tắch phương sai ANOVA 1 nhân tố ựể phân tắch và so sánh sự sai khác giữa các mô hình nuôị
X = A B 100 x Ăcfu/ml) = X.1 K.V
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 27
PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả về thành phần loài vi khuẩn Vibrio spp gây bệnh trên tôm ở các mô hình nuôị
Thành phần loài vi khuẩn Vibrio spp gây bệnh trên tôm ở các mô hình nuôi ựược giám ựịnh qua phản ứng sinh hóa sau:
Bảng 3.1. đặc tắnh sinh hóa của Vibrio spp phân lập ựược
Các loài phân lập ựược đặc ựiểm sinh hóa
V. harveyi V. alginolyticus V. parahaemolyticus
Màu KL/TCBS Xanh nhạt Vàng Xanh
Nhuộm Gram - - - Hình dạng VK TK TK TK OF +/+ +/+ +/+ ONPG - - - ADH - - - LDC - + + ODC + + + CIT +(w) + + H2S - - - URE - - - TDA - - + IND + + + VP - +(w) - GEL + + + GLU + + + MAN + + + INO - - - SOR - - -
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 28 RHA - - - SAC +(w) + - MEL - +(w) - AMY + + + ARA - +(w) +
Sinh trưởng trong nước pepton với:
0% NaCl 2% NaCl 6% NaCl 8% NaCl 10% NaCl - + + - - = = - + + + - = = - + + + -
Ghi chú: Ộ+Ợ:Phản ứng dương tắnh ỘTKỢ:Trực khuẩn
Ộ-Ợ:Phản ứng âm tắnh ỘwỢ:phản ứng yếu
đối chiếu với kết quả phản ứng sinh hóa API 20E của N.B. Buller (2004) [29], theo Cục thuốc và thực phẩm Mỹ (2001) [6], chúng tôi nhận thấy có 90% các phản ứng sinh hóa của loài 1 giống với V. harveyi, 85,7% các phản ứng sinh hóa của loài 2 giống với V. alginolyticus và 90,5% các phản ứng của loài 3 giống với V. parahaemolyticus. Như vậy, dựa vào hình thái, màu sắc của khuẩn lạc, hình thái vi khuẩn khi nhuộm Gram cùng với kết quả thử phản ứng sinh hoá có thể kết luận: Loài vi khuẩn 1 là V. harveyi, loài 2 là
V. alginolyticus và loài 3 là V. parahaemolyticus.
V. harveyi, V. alginolyticus và V. parahaemolyticus phát triển trên môi
trường TCBS có khuẩn lạc tròn ựều; V. harveyi khuẩn lạc màu xanh nhạt, ựường kắnh từ 2 Ờ 3mm. V. parahaemolyticus khuẩn lạc màu xanh, ựường kắnh 3 - 5mm V. alginolyticus khuẩn lạc màu vàng, ựường kắnh 2 - 3mm. Các vi khuẩn nhuộm Gram, bắt màu hồng (gram âm), hình dạng trực khuẩn. V.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 29
harveyi và V. alginolyticus ựều có khả năng lên men ựường saccarose, tuy
nhiên V. harveyi phản ứng với saccarose yếu hơn; ngoài ra còn có sự khác biệt về phản ứng VP, LDC, MEL và ARẠ V. parahaemolyticus không có khả năng sử dụng ựường saccarosẹ
Khi thử khả năng sinh trưởng của 3 loài vi khuẩn trên trong môi trường pepton với nồng ựộ muối khác nhau thì thấy cả 3 loài ựều không phát triển ở ựộ muối 0%, riêng V. harveyi khả năng thắch nghi với môi trường có ựộ muối thấp hơn; biểu hiện là chỉ phát triển ựược ở ựộ muối cao nhất là 6%, V. alginolyticus
và V. parahaemolyticus có khả năng phát triển tốt ở ựộ muối 8%.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 30
Hình 3.1. Khuẩn lạc V. alginolyticus trên môi Hình 3.2Hình dạng vi khuẩn trường TCBS màu vàng V.alginolyticus khi nhuộm gram
A B
Hình 3.3. Kết quả phản ứng sinh hóa của V. alginolyticus trên kắt API 20E (A); Trên môi trường O/F (B)
Hình 3.4. Khuẩn lạc V. parahaemolyticus trên Hình 3.5 Hình dạng vi khuẩn môi trường TCBS màu xanh V. parahaemolyticus khi nhuộm gram
A B
Hình 3.6. Kết quả phản ứng sinh hóa của V. parahaemolyticus trên kắt API 20E (A); Trên môi trường O/F (B)
Hình 3.7. Khuẩn lạc V. harveyi trên môi trường Hình 3.8. Hình dạng vi khuẩn V. harveyi TCBS màu xanh nhạt khi nhuộm gram
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 31
A B
Hình 3.9. Kết quả phản ứng sinh hóa của V. harveyi trên kắt API 20E (A); Trên môi trường O/F (B)
3.2. Tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình nuôị
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 32 40 45 50 55 60
Mô hình 1 Mô hình 2 Mô hình 3
V. alginolyticus
Hình 3.10. Biểu ựồ tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú
ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 1
Kết quả về tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 1 cho thấy, ở các mô hình nuôi chỉ xuất hiện duy nhất 1 loài là V.
alginolyticus, với tỷ lệ nhiễm từ 52 ựến 56(%). Tỷ lệ nhiễm ở mô hình 2 cấp giảm
so với mô hình 1 và mô hình 3. Tuy nhiên theo phân tắch ANOVA thì tỷ lệ nhiễm loài này giữa 3 mô hình nuôi lại không có sự sai khác (P>0,05)
3.2.2. Tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 2
0 20 40 60 80
Mô hình 1 Mô hình 2 Mô hình 3
V. alginolyticus V. parahaemolyticus
Hình 3.11. Biểu ựồ tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 2
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 33
Thành phần loài Vibrio spp ở tháng nuôi thứ 2 nhiều hơn so với tháng nuôi thứ 1, ựó là sự xuất hiện thêm của V. parahaemolyticus với tỷ lệ nhiễm dao ựộng trong khoảng 10,67 - 28(%) còn V. alginolyticus là 53,33 - 72(%). Tỷ lệ nhiễm 2 loài này ở mô hình nuôi 1 cấp cao hơn so với mô hình nuôi 2 cấp và 3 cấp. Theo phân tắch ANOVA thì tỷ lệ nhiễm cả hai loài này giữa 3 mô hình nuôi có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05).
3.2.3. Tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 3
0 20 40 60 80 100
Mô hình 1 Mô hình 2 Mô hình 3
V. alginolyticus V. parahaemolyticus V. harveyi
Hình 3.12. Biểu ựồ tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 3
Ở tháng nuôi thứ 3, thành phần loài Vibrio spp tiếp tục tăng, ngoài V.
alginolyticus và V. parahaemolyticus còn có V. harveyi với tỷ lệ của các loài
lần lượt là 52 - 84(%), 12 - 32(%) và 10,67 - 32(%). Tỷ lệ nhiễm của các loài này có xu hướng giảm dần theo cấp ao, cao nhất là ở mô hình nuôi 1 cấp sau