2.2.1. Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu
Nguyên liệu cám gạo tám được thu nhận, yêu cầu cám gạo tám phải sáng, có mùi thơm đặc trưng, không lẫn sạn.. và được đóng gói trong túi nhựa 5kg/túi mang về phòng thí nghiệm. Tại phòng thí nghiệm, cám gạo được sấy bằng lò vi sóng trong 1
phút để làm giảm hàm lượng nước, sau đó làm nguội và đóng gói trong túi tối màu và bảo quản ở nhiệt độ 2÷4oC để sử dụng cho các thí nghiệm tách chiết acid phytic từ cám gạo tám. Trước khi làm thí nghiệm, cần xử lý loại bỏ lipid trong cám gạo bằng cách ngâm cám trong dung môi hexan với tỷ lệ 4/1 (v/w) qua đêm. Sau đó, ly tâm hỗn hợp ở 10000 vòng/phút trong 10 phút. Tách bỏ dung môi bằng cách lọc quá giấy lọc whatman số 1 thu được cám gạo, để khô và chuẩn bị cho các thí nghiệm tách chiết acid phytic từ cám gạo.
Nguyên liệu cá tra được thu mua còn sống, khối lượng khoảng 1,2÷1,5 kg/con và được mang về phòng thí nghiệm tiến hành phi lê, loại bỏ da, xương, nội tạng, mỡ bụng. Thịt cá được cắt thành miếng có kích thước nhỏ, trộn đều và được xay nhỏ bằng máy xay thịt (TA 57D, Ytalia). Thịt cá xay này được sử dụng trong nghiên cứu khả năng chống oxy hóa lipid trong thịt cá xay của acid phytic chiết từ cám gạo.
2.2.2. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Xác định thành phần hóa học cơ bản Cám gạo
Xử lý Tách lipid
Xác định điều kiện chiết thích hợp (tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian đối với từng dung môi, phương pháp chiết) và lựa chọn điều kiện chiết với dung môi thích hợp nhất.
Chiết tách acid phytic
Phân ly
Dịch chiết
Bã
Xác định khả năng chống oxy hóa lipid trong thịt cá tra xay của dịch chiết acid phytic từ cám gạo.
Xác định hàm lượng acid phytic và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết acid phytic từ cám gạo
Ứng dụng dịch chiết acid phytic từ cám gạo tám. Thảo luận, đánh giá kết quả thực nghiệm - Kết luận
2.2.3.Xác định thành phần hóa học cơ bản của cám gạo
Cám gạo tám sau khi được đưa về phòng thí nghiệm được tiến hành sang lọc để loại bỏ tạp chất, trấu… Sau đó cám gạo được đem đi xác định thành phần hóa học cơ bản như xác định độ ẩm, hàm lượng tro, protein, lipid, glucid và khoáng photpho để đánh giá khả năng khai thác đối tượng nghiên cứu và làm nền cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.4. Xác định loại dung môi và điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo tám
2.2.4.1.Quy trình dự kiến chiết tách acid phytic từ cám gạo
Acid phytic là một chất acid yếu, phân cực nên hòa tan được trong những loại dung môi có tính phân cực, chúng tồn tại trong cám gạo dưới dạng muối phytin, có độ phân cực cao do chứa nhiều nhóm phosphate, nên dung môi chiết phải có độ phân cực cao và có đặc tính hòa tan chọn lọc để tăng hiệu quả chiết [63]. Do đó một số dung môi phù hợp cho chiết tách acid phytic nhưacid clohydric (HCl), acid tricloaxetic (TCA), acid sunfuric (H2SO4), acid nitric (HNO3) [21], [53].
Dựa vào nghiên cứu của Vincient M. Clemon [62], đề tài đưa ra quy trình chiết tách acid phytic từ cám gạo dự kiến được thể hiện trên hình 2.3.
Tiến hành: Cân chính xác 2g cám gạo, đem xử lý loại bỏ lipid sau đó đem chiết bằng các dung môi theo điều kiện chiết thích hợp. Sau đó mang hỗn hợp chiết đi ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 15 phút, tách lấy dịch ly tâm, lọc qua giấy lọc Whatman số 1thu được dịch chiết. Lấy 5ml dịch chiết và thêm vào đó 5ml dung dịch (4g FeCl3
trong 1lít HCl 0,6%) rồi mang đun sôi trong 15 phút trên bể ổn nhiệt 100oC. Hỗn hợp được làm nguội ở nhiệt độ 22oC. Sau đó, mang hỗn hợp đi ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch thu được kết tủa. Rửa sạch kết tủa để loại bỏ photsphate hòa tan bằng cách thêm vào đó 5 ml nước cất, lắc đều và ly tâm thu lại kết tủa sau đó lặp lại thêm lần nữa. Thêm vào kết tủa 5ml NaOH 1M, rồi ly tâm. Loại bỏ kết tủa, dịch ly tâm được lọc qua giấy lọc Whatman số 1thu được dịch chiết acid phytic.
Hình 2.4. Sơ đồ nghiên cứu quy trình tách chiết acid phytic từ cám gạo dự kiến 2.2.4.2.Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo bằng dung môi HCl loãng
Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp cho quá trình chiết tách acid phytic từ cám gạo bằng dung môi HCl loãng được trình bày trên sơ đồ ở hình 2.5.
Cám gạo tám
Chiết
Loại dung môi thích hợp?
Tỷ lệ dung môi/ cám gạo thích hợp? Nồng độ dung môi thích hợp? Xác định nhiệt độ chiết thích hợp? Xác định thời gian chiết thích hợp? Ly tâm, thu dich chiết
Xử lý
Đun nóng FeCl3
Làm nguội Ly tâm, thu kết tuả
Ly tâm, thu dịch chiết acid phytic Rửa 2 lần với nước
Thêm NaOH 1M
Xác định hàm lượng acid phytic
Chọn các thông số thích hợp cho quá trình chiết tách acid phytic từ cám gạo tám
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo bằng dung môi HCl loãng
(1)Thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp được tiến hành như sau: Cân chính xác 2g cám gạo, đem xử lý loại bỏ lipid sau đó đem chiết bằng dung môi HCl nồng độ 2,5% trong 3 giờ ở 40oC với lệ dung môi/ nguyên liệu lần lượt là 5/1, 10/1, 15/1, 20/1và 25/1 (ml/g). Sau đó mang hỗn hợp chiết đi ly tâm ở 10000
Cám gạo tám Chiết bằng HCl Xử lý Tỷ lệ w/v (ml/g): 5/1, 10/1, 15/1, 20/1, 25/1 Nồng độ HCl sử dụng 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4% Nhiệt độ chiết (oC) : 30, 40, 50, 60, 70
Thời gian chiết 2h, 2,5h, 3h, 3,5h, 4h
Ly tâm, thu dich chiết Đun nóng FeCl3
Làm nguội Ly tâm, thu kết tuả
Ly tâm, thu dịch chiết acid phytic Rửa 2 lần với nước
Thêm NaOH 1M
Xác định hàm lượng acid phytic
Chọn các thông số thích hợp cho quá trình chiết tách acid phytic từ cám gạo tám
vòng/phút trong 15 phút, tách lấy dịch ly tâm, lọc qua giấy lọc Whatman số 1thu được dịch chiết. Lấy 5ml dịch chiết và thêm vào đó 5ml dung dịch (4g FeCl3 trong 1lít HCl 0,6%) rồi mang đun sôi trong 15 phút trên bể ổn nhiệt 100oC. Hỗn hợp được làm nguội ở nhiệt độ 22oC. Sau đó, mang hỗn hợp đi ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch thu được kết tủa. Rửa sạch kết tủa để loại bỏ photsphate hòa tan bằng cách thêm vào đó 5 ml nước cất, lắc đều và ly tâm thu lại kết tủa sau đó lặp lại thêm lần nữa. Thêm vào kết tủa 5ml NaOH 1M, rồi ly tâm. Loại bỏ kết tủa, dịch ly tâm được lọc qua giấy lọc Whatman số 1thu được dịch chiết acid phytic.
(2)Thí nghiệm xác định nồng độ dung dịch HCl thích hợp được tiến hành như sau: Cân chính xác 2g cám gạo mang đi xử lý loại bỏ lipid sau đó đem chiết bằng dung môi HCl trong 3 giờ ở 40oC với lệ dung môi/ nguyên liệu thích hợp chọn ở thí nghiệm (1), nồng độ HCl thay đổi từ 2% đến 4% (bước nhảy là 0,5%). Hỗn hợp sau khi chiết được thực hiện các bước tiếp theo giống như thí nghiệm (1) để thu được dịch chiết acid phytic từ cám gạo.
(3) Thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết thích hợp bằng dung môi HCl được tiến hành như sau:
Cân chính xác 2g cám gạo mang đi xử lý loại bỏ lipid sau đó đem chiết bằng dung môi HCl trong 3 giờ với lệ dung môi/ nguyên liệu thích hợp chọn ở thí nghiệm (1), nồng độ HCl thích hợp đã chọn ở thí nghiệm (2), nhiệt độ chiết được bố trí thay đổi từ 30oC đến 70oC (bước nhảy là 10oC). Hỗn hợp sau khi chiết được thực hiện các bước tiếp theo giống như thí nghiệm (1) để thu được dịch chiết acid phytic từ cám gạo.
(4) Thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp khi sử dụng dung môi HCl được tiến hành như sau:
Cân chính xác 2g cám gạo mang đi xử lý loại bỏ lipid sau đó đem chiết bằng dung môi HCl với tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu thích hợp chọn ở thí nghiệm (1), nồng độ HCl thích hợp đã chọn ở thí nghiệm (2), nhiệt độ chiết chiết thích hợp đã chọn ở thí nghiệm (3), thời gian chiết thay đổi từ 2h đến 4h (bước nhảy là 0,5h). Hỗn hợp sau khi chiết được thực hiện các bước tiếp theo giống như thí nghiệm (1) để thu được dịch chiết acid phytic từ cám gạo.
2.2.4.3. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo bằng dung môi H2SO4 loãng
Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp cho quá trình chiết tách acid phytic từ cám gạo bằng dung môi H SO loãng được trình bày trên sơ đồ ở hình 2.6.
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo bằng dung môi H2SO4loãng
(1)Thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp tiến hành như sau: Cân chính xác 2g cám gạo mang đi xử lý loại bỏ lipid sau đó đem chiết bằng dung môi H2SO4 nồng độ 5% trong 0,5 giờ ở 40oC với lệ dung môi/ nguyên liệu lần
Cám gạo tám Chiết bằng H2SO4 Xử lý Tỷ lệ w/v (ml/g): 5/1, 10/1, 15/1, 20/1, 25/1 Nồng độ H2SO4 sử dụng 3%, 5%, 7%, 9%, 11% Nhiệt độ chiết (oC) : 30, 40, 50, 60, 70
Thời gian chiết (h) 0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,5
Ly tâm, thu dich chiết Đun nóng FeCl3
Làm nguội Ly tâm, thu kết tuả
Ly tâm, thu dịch chiết acid phytic Rửa 2 lần với nước
Thêm NaOH 1M
Xác định hàm lượng acid phytic
Chọn các thông số thích hợp cho quá trình chiết tách acid phytic từ cám gạo tám
lượt là 5/1, 10/1, 15/1, 20/1và 25/1 (ml/g). Sau đó mang hỗn hợp chiết đi ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 15 phút, tách lấy dịch ly tâm, lọc qua giấy lọc Whatman số 1thu được dịch chiết. Lấy 5ml dịch chiết và thêm vào đó 5ml dung dịch (4g FeCl3
trong 1lít HCl 0,6%) rồi mang đun sôi trong 15 phút trên bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 100oC. Hỗn hợp được làm nguội ở nhiệt độ 22oC. Sau đó, mang hỗn hợp đi ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch thu được kết tủa. Rửa sạch kết tủa để loại bỏ photsphate hòa tan bằng cách thêm vào đó 5 ml nước cất, lắc đều và ly tâm thu lại kết tủa sau đó lặp lại thêm lần nữa. Thêm vào kết tủa 5ml NaOH 1M, rồi ly tâm. Loại bỏ kết tủa, dịch ly tâm được lọc qua giấy lọc Whatman số 1thu được dịch chiết acid phytic.
(2)Thí nghiệm xác định nồng độ dung dịch H2SO4 thích hợp được tiến hành như sau: Cân chính xác 2g cám gạo mang đi xử lý loại bỏ lipid sau đó đem chiết bằng dung môi H2SO4 trong 0,5 giờ ở 40oC với lệ dung môi/ nguyên liệu thích hợp chọn ở thí nghiệm (1), nồng độ H2SO4 thay đổi từ 3% đến 11% (bước nhảy là 2%). Hỗn hợp sau khi chiết được thực hiện các bước tiếp theo giống như thí nghiệm (1) để thu được dịch chiết acid phytic từ cám gạo.
(3) Thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết thích hợp bằng dung môi H2SO4 được tiến hành như sau:
Cân chính xác 2g cám gạo mang đi xử lý loại bỏ lipid sau đó đem chiết bằng dung môi H2SO4trong 0,5 giờ với lệ dung môi/ nguyên liệu thích hợp chọn ở thí nghiệm (1), nồng độ H2SO4 thích hợp đã chọn ở thí nghiệm (2), nhiệt độ chiết được bố trí thay đổi từ 30oC đến 70oC (bước nhảy là 10oC). Hỗn hợp sau khi chiết được thực hiện các bước tiếp theo giống như thí nghiệm (1) để thu được dịch chiết acid phytic từ cám gạo.
(4) Thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp khi sử dụng dung môi H2SO4
được tiến hành như sau:
Cân chính xác 2g cám gạo mang đi xử lý loại bỏ lipid sau đó đem chiết bằng dung môi H2SO4 với tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu thích hợp chọn ở thí nghiệm (1), nồng độ H2SO4 thích hợp đã chọn ở thí nghiệm (2), nhiệt độ chiết chiết thích hợp đã chọn ở thí nghiệm (3), thời gian chiết thay đổi từ 0,25hđến 1,25h (bước nhảy là 0,25h). Hỗn hợp sau khi chiết được thực hiện các bước tiếp theo giống như thí nghiệm (1) để thu được dịch chiết acid phytic từ cám gạo.
2.2.4.4. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo bằng dung môi TCA loãng
Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp cho quá trình chiết tách acid phytic từ cám gạo bằng dung môi TCA loãng được trình bày trên sơ đồ ở hình 2.7.
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo bằng dung môi TCA loãng
Cám gạo tám Chiết bằng TCA Xử lý Tỷ lệ w/v (ml/g): 5/1, 10/1, 15/1, 20/1, 25/1 Nồng độ TCA sử dụng 3%, 5%, 7%, 9%, 11% Nhiệt độ chiết (oC) : 30, 40, 50, 60, 70
Thời gian chiết: 2h, 2,5h, 3h, 3,5h, 4h
Ly tâm, thu dich chiết Đun nóng FeCl3
Làm nguội Ly tâm, thu kết tuả
Ly tâm, thu dịch chiết acid phytic Rửa 2 lần với nước
Thêm NaOH 1M
Xác định hàm lượng acid phytic
Chọn các thông số thích hợp cho quá trình chiết tách acid phytic từ cám gạo tám
(1)Thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợpđược tiến hành như sau:
Cân chính xác 2g cám gạo mang đi xử lý loại bỏ lipid sau đó đem chiết bằng dung môi TCA nồng độ 9% trong 3 giờ ở 40oC với lệ dung môi/ nguyên liệu lần lượt là 5/1, 10/1, 15/1, 20/1và 25/1 (ml/g). Sau đó mang hỗn hợp chiết đi ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 15 phút, tách lấy dịch ly tâm, lọc qua giấy lọc Whatman số 1thu được dịch chiết. Lấy 5ml dịch chiết và thêm vào đó 5ml dung dịch (4g FeCl3 trong 1lít HCl 0,6%) rồi mang đun sôi trong 15 phút trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 100oC. Hỗn hợp được làm nguội ở nhiệt độ 22oC. Sau đó, mang hỗn hợp đi ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch thu được kết tủa. Rửa sạch kết tủa để loại bỏ photsphate hòa tan bằng cách thêm vào đó 5 ml nước cất, lắc đều và ly tâm thu lại kết tủa sau đó lặp lại thêm lần nữa. Thêm vào kết tủa 5ml NaOH 1M, rồi ly tâm. Loại bỏ kết tủa, dịch ly tâm được lọc qua giấy lọc Whatman số 1thu được dịch chiết acid phytic.
(2)Thí nghiệm xác định nồng độ dung dịch TCA thích hợp được tiến hành như sau: Cân chính xác 2g cám gạo mang đi xử lý loại bỏ lipid sau đó đem chiết bằng dung môi TCA trong 3 giờ ở 40oC với lệ dung môi/ nguyên liệu thích hợp chọn ở thí nghiệm (1), nồng độ TCA thay đổi từ 3% đến 11% (bước nhảy là 2%). Hỗn hợp sau khi chiết được thực hiện các bước tiếp theo giống như thí nghiệm (1) để thu được dịch chiết acid phytic từ cám gạo.
(3) Thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết thích hợp bằng dung môi TCA được tiến hành như sau:
Cân chính xác 2g cám gạo mang đi xử lý loại bỏ lipid sau đó đem chiết bằng dung môi TCA trong 3 giờ với lệ dung môi/ nguyên liệu thích hợp chọn ở thí nghiệm (1), nồng độ TCA thích hợp đã chọn ở thí nghiệm (2), nhiệt độ chiết được bố trí thay đổi từ30oC đến 70oC (bước nhảy là 10oC). Hỗn hợp sau khi chiết được thực hiện các bước tiếp theo giống như thí nghiệm (1) để thu được dịch chiết acid phytic từ cám gạo.
(4) Thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp khi sử dụng dung môi TCA được tiến hành như sau:
Cân chính xác 2g cám gạo mang đi xử lý loại bỏ lipid sau đó đem chiết bằng dung môi TCA với tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu thích hợp chọn ở thí nghiệm (1), nồng độ TCA thích hợp đã chọn ở thí nghiệm (2), nhiệt độ chiết chiết thích hợp đã chọn ở
khi chiết được thực hiện các bước tiếp theo giống như thí nghiệm (1) để thu được dịch chiết acid phytic từ cám gạo.
2.2.4.5. Lựa chọn dung môi thích hợp cho chiết tách acid phytic từ cám gạo tám
- Tiến hành chiết acid phytic theo các thống số thích hợp đã chọn được đối với từng loại dung môi.
-So sánh hàm lượng acid phyticcủa 3 mẫu dịch thu được từ quá trình chiết cám gạo sử dụng 3 loại dung môi trên, chọn ra dung môi chiết thích hợp nhất.
- Sử dụng dung môi chiết thích hợp kết hợp với sự hỗ trợ của siêu âm thay thế phương pháp chiết thường, đánh giá hàm lượng acid phytic thu được.