L ỜI CẢM ƠN
2.4. Phương pháp nghiên cứu
Sơ đồ khối phương pháp nghiên cứu
Hình 2.1. Sơđồ khối phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu
- Mẫu ngao thu từ những hộ có dấu hiệu ngao chết hàng loạt. - Mẫu ngao khỏe thu từ những hộ ngao khỏe mạnh bình thường.
Mẫu thu được bảo quản trong túi PE và bảo quản ở nhiệt độ từ 2°C-8°C trong thờigian từ 24- 48 h
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn
Dựa trên phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuNn ở động vật thủy sản của Frerichs và Millar (1983, 1993) và Whitman (2004).
Nuôi cấy phân lập và định danh vi khuNn
Gây nhiễm vi khuNn
Gây nhiễm vi khuNn ở nhiệt độ 33°C và độ mặn
33‰ Gây nhiễm vi khuNn
đơn nhân tố
Gây nhiễm vi khuNn ở nhiệt độ 35°C và độ
mặn 35‰ Mẫu ngao có dấu hiệu chết
hàng loạt và mẫu ngao khỏe
2.4.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
- Dùng que cấy cấy ria trên thạch đĩa, mục đích cấy ria để có những khuNn lạc riêng rẽ.
- Dùng que cấy vô trùng lấy mẫu bệnh phNm từ tuyến tiêu hóa của ngao bệnh và ngao khỏe (mẫu đối chứng). Vị trí lấy mẫu được sát trùng bằng bông cồn 700 trước khi cấy để tránh tạp nhiễm vi khuNn từ bên ngoài.
- Sau khi lấy mẫu bệnh phNm tiến hành cấy trên môi trường thạch chọn lọc (TCBS) cho vi khuNn Vibrio spp.
- Sau khi cấy xong đưa đĩa thạch vào nuôi cấy ở 28-30oC trong 24 h
- Sau 24h kiểm tra sự phát triển của khuNn lạc. Dựa vào màu sắc, hình dạng, kích thước khuNn lạc để phân biệt các loại khuNn lạc có trên đĩa lồng, từđó chọn ra các loại khuNn lạc nghi ngờ.
Nuôi cấy thuần chủng:
- Mởđĩa phân lập có khuNn lạc nghi ngờ bên cạnh ngọn lửa đèn cồn. - Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuNn lạc nghi ngờ riêng rẽ.
- Cấy lên đĩa thạch Brain heart infusion agar (BHIA, Merck) hoặc Tryptic Soy Agar (TSA, Merck) 2% NaCl
- Nuôi cấy trong tủấm ở nhiệt độ 28 – 30oC trong 24 h sẽđược vi khuNn thuần chủng.
2.4.2.2. Phương pháp nghiên cứu hình thái vi khuẩn
Để nghiên cứu hình thái vi khuNn, người ta dùng phương pháp nhuộm gram.
Nhuộm gram tiến hành như sau:
- Sau khi được chủng vi khuNn thuần, lấy pipet cho vài giọt nước muối 2% lên lam kính sau đó dùng que cấy vô trùng lấy vi khuNn cho vào lam dàn đều để khô ở nhiệt độ phòng.
- Hơ cao lam kính trên ngọn lửa đèn cồn để cốđịnh mẫu vi khuNn. - Nhuộm Gram theo các bước sau:
+ Nhỏ dung dịch1: tím tinh thể (Crystal violet) lên tiêu bản, để yên 30-60 giây. + Rửa nước nhanh, vNy khô.
+ Nhỏ dung dịch 2: lugol để cốđịnh trong 1 phút (tiêu bản có màu đen). + Rửa nước nhanh, vNy khô.
+ N hỏ dung dịch 3: cồn aceton để nghiêng đầu một bên lam để cồn chảy qua chỗ phết vi khuNn để tNy màu.
+ Rửa nước nhanh, vNy khô.
+ Nhỏ dung dịch 4: safranin để cốđịnh 1 đến 2 phút.
+ Rửa nước, để khô hoặc dùng giấy thấm khô, không làm xước mẫu.
- Soi dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu (X100). Vi khuNn gram âm bắt màu hồng và gram dương bắt màu xanh tím.
2.4.2.3. Phương pháp kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn
Sau khi phân lập, cần tiến hành giám định đểđịnh loại các loại vi khuNn phân lập được. Trong đề tài này, chúng tôi giám định các vi khuNn bằng kít API-20E có bổ sung một số phản ứng sinh hóa bằng phương pháp truyền thống như O/F, oxidase, catalase. Đọc kết quả bằng phần mềm đọc kết quả của kít thử API 20E.
- Thử phản ứng sinh hoá bằng kít thử API - 20 E:
Phương pháp này dùng 21 tiêu chuNn thử sinh hóa cho phép định tên một số loài vi khuNn hình que, gram âm và thuộc họ Enterobacteriaceae.
Kít thử API 20E gồm có các ống nghiệm nhỏ (microtube) trong có chứa các chất nền đã khử nước. Trong quá trình ủ, hoạt động của vi khuNn sẽ làm chuyển màu hoặc làm đục môi trường. Sau 24h đọc các phản ứng đối chiếu theo bảng kết quả để định tên.
Chuẩn bị kit
+ ChuNn bị hộp ủ và đổ 5ml nước cất (hoặc nước khử khoáng) vào chỗ lõm để tạo hơi Nm
+ Kít thử API 20E không dùng trực tiếp các mẫu bệnh phNm
+ Thu mẫu bệnh phNm, cấy lên môi trường chọn lọc. Sau đó tiến hành chọn khuNn lạc để nuôi thuần; sau 24 giờ nuôi cấy, lấy vi khuNn thuần để pha loãng thành dịch huyền phù bằng 5ml NaCl 2%.
Chuẩn bịủ
+ Dùng một pipet lấy dịch huyền phù vi khuNn cho đầy vào các ống.
+ Đổ 1 lớp dầu vào các ống ADH, LDC, ODC, H2S, URE, VP và GEL để tạo môi trường yếm khí.
Ủ mẫu
+ Ủ các mẫu phản ứng đó ở nhiệt độ 27 – 29oC thời gian 24 - 48h.
Đọc kết quả
Đọc kết quả theo bảng đọc và dùng các thuốc thử hiển thị kết quả: + Thử TDA: cho 1 giọt thuốc thử TDA chuyển màu nâu đỏ là dương tính.
+ Thử IND: cho 1 giọt thuốc thử JAMES phát triển màu hồng trong ống thử là dương tính.
+ Thử VP: cho 1 giọt thuốc thử VP 1 và 1 giọt thuốc thử VP 2, đợi ít nhất 10 phút chuyển màu hồng hoặc đỏ là dương tính. Nếu chuyển màu hồng nhẹ sau 10 phút là âm tính.
+ Thử NO2: cho 1 giọt NIT 1 và 1 giọt NIT 2 vào ống GLU. Đợi sau 2 - 5 phút chuyển màu đỏ là dương tính. Chuyển màu vàng có thể chúng khửđến N2 (1 số trường hợp sinh hơi ởđáy) cho thêm 2-3mg Zn vào ống GLU. Sau 5 phút nếu ống chuyển lại màu vàng là phản ứng sinh khí N 2 là dương tính; nếu ống chuyển màu da cam đến đỏ là âm tính.
Hình 2.2. Sơđồ phân lập vi khuẩn trên ngao
Hình 2.3. Nghêu M. lyrata
Mẫu ngao
Nuôi cấy phân lập
Kiểm tra hình thái
khuNn lạc Nuôi cấy thuần chủng
Thử các phản ứng sinh hóa
Nhuộm Gram
Hình 2.4. Phân lập vi khuẩn Vibrio trên ngao 2.4.3. Phương pháp đếm mật độ vi khuẩn
Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuNn lạc mọc trên môi trường thạch. Pha loãng dịch huyền phù tế bào theo cơ số 10 thành các nồng độ: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 , 10-8…Tiến hành cấy mẫu ở các độ pha loãng khác nhau vào các đĩa petri (mỗi nồng độ cấy lặp ba lần).
Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủấm ở nhiệt độ 30oC trong 24 giờ.
Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đếm khuNn lạc và tính số lượng tế bào trong 1 ml mẫu theo công thức:
Mi(CFU/ml) = Ai x Di/V
Trong đó : Ai: là số khuNn lạc trung bình/đĩa Di: là độ pha loãng
V: là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)
Mật độ tế bào trung bình MI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau.
2.4.4. Phương pháp gây nhiễm các chủng vi khuẩn Vibrio sp 2.4.4.1. Vật liệu nghiên cứu
- Ngao dùng thí nghiệm: N gao có khối lượng khoảng 70-80 con/1kg được thu
Nam Định. N gao khỏe mạnh, màu sắc tươi sáng và được nuôi thuần trong bể nuôi phòng thí nghiệm (khoảng 1 tuần trước khi gây nhiễm) để tạo sựổn định hơn về điều kiện sống, các yếu tố môi trường, ngoại cảnh tác động đến quá trình sống của ngao so với ngao sống bên ngoài tự nhiên.
- Hai chủng vi khuNn thuần chủng thuộc 2 loài V. parahaemolyticus và V.
alginolyticus
- Bể thí nghiệm composite tròn thể tích 250 lít, xô nhựa tròn thể tích 15 lít; thùng xốp kích thước 40 x 60 x 40cm.
- Cát làm nền đáy cho nghêu được lấy trực tiếp từ bãi nuôi nghêu Cát Hải, Hải Phòng. Tảo Chlorella sp nuôi sinh khối được sử dụng làm thức ăn cho ngao thí nghiệm.
- Nước ót và muối đểđiều chỉnh độ mặn; máy sục khí, máy nâng nhiệt điều khiển tựđộng DOTECH (Hàn Quốc).
- Độ mặn đo bằng máy khúc xạ kế hãng Atago (Nhật Bản), nhiệt độ và pH đo bằng máy đo nhiệt độ và pH hiệu WTW 310i (Đức).
2.4.4.2. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm bố trí với 3 thí nghiệm bao gồm: Thí nghiệm 1: gây nhiễm vi khuNn đơn nhân tố;
Thí nghiệm 2: gây nhiễm vi khuNn đa nhân tố nhiệt độ 33°C và độ mặn 33‰; Thí nghiệm 3: gây nhiễm vi khuNn đa nhân tố nhiệt độ 35°C và độ mặn 35‰.
2.4.4.3. Cách tiến hành thí nghiệm
Kết quả phân lập và định danh vi khuNn cho thấy ngao thu được qua các đợt ngao chết có tỷ lệ nhiễm khuNn cao, thành phần loài vi khuNn đa dạng điển hình như một số loài vi khuNn V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. tubiashii, V. splendidus là những tác nhân gây bệnh ở nhiều loài động vật thủy sản khác nhau. Mặc dù vậy, việc phân lập được vi khuNn nhiễm trên ngao không thể nói rằng vi khuNn là tác nhân gây chết ngao. Trong nhiều trường hợp vi khuNn chỉ là tác nhân cơ hội hoặc chỉ có thể gây chết khi có cùng gặp điều kiện môi trường bất lợi với ký chủ. Vì những nhận định như trên chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm gây nhiễm đơn và đa nhân tố để đánh giá vai trò của vi khuNn liên quan đến hiện tượng ngao nuôi thương phNm chết hàng loạt nghiên cứu đã tiến hành các thí nghiệm sau:
Hai chủng vi khuNn thuộc 2 loài V. parahaemolyticus và V. alginolyticus phân lập được trên ngao yếu thu được tại Thanh Hóa, Thái Bình, Nam Định, Hải Phòng . Từ các ống vi khuNn thuần tiến hành ria trên đĩa thạch môi trường Nutrient Agar, nuôi trong 24h ở tủ ấm 29oC – 30oC. Chọn một khuNn lạc rời trên đĩa thạch đem nuôi cấy lắc trong môi trường tăng sinh vi khuNn (BHIB)2% NaCl ở điều kiện lắc 200 vòng/phút và nhiệt độ 30oC. Vi khuNn sau khi được nuôi cấy tăng sinh đem ly tâm ở 7.000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút. Loại bỏ phần dịch nổi thu vi khuNn, rửa qua nước muối sinh lý 3 lần. Pha loãng vi khuNn bằng nước muối sinh lý, mật độ vi khuNn ban đầu được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng OD600nm sau đó kiểm tra lại bằng phương pháp pha loãng và định lượng trên đĩa thạch.
Hình 2.5: Sơđồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của vi khuẩn lên ngao
Mỗi một nồng độ thí nghiệm và đối chứng được bố trí lặp lại 3 lần với 3 bể thí V. parahaemolyticus 104cfu/ml V. alginolyticus 104cfu/ml Ngao thí nghiệm ở nhiệt độ (29-32 oC) và độ mặn 28- 30‰ V. parahaemolyticus 106cfu/ml V. alginolyticus 106cfu/ml V. parahaemolyticus 108cfu/ml V. alginolyticus 108cfu/ml ĐC/PBS ĐC/PBS
khử trùng bằng iodine) mô phỏng điểu kiện bãi tự nhiên và cấp nước biển sạch đã được lọc và khử trùng với mức nước 15-20 cm.
Tiến hành gây nhiễm vi khuNn cho ngao bằng phương pháp ngâm, 45 ngao được ngâm riêng với mỗi loại vi khuNn (V. parahaemolyticus và V. alginolyticus) và nồng độ (104 , 106, 108) trong vòng 1 giờ sau đó chia ra 3 bể mỗi bể thả 15 ngao đã được gây nhiễm. Trong quá trình thí nghiệm, duy trì chế độ sục khí, bổ sung tảo Chlorella sp mật độ 104 tb/lít, theo dõi và ghi chép số lượng ngao chết mỗi ngày.
Gây nhiễm vi khuẩn đa nhân tố
Ngao khỏe được kích cỡ 70 -80 con/kg thu được tại Nam Định được sử dụng làm thí nghiệm. ChuNn bị các chủng vi khuNn V. parahaemolyticus, V. alginolyticus phân lập được qua các đợt ngao chết tại Nam Định,Thái Bình, Hải Phòng và Thanh Hóa được sử dụng cho thí nghiệm.
Chọn một khuNn lạc rời trên đĩa thạch đem nuôi cấy lắc trong môi trường
Nutrient broth ởđiều kiện lắc 200 vòng/phút và nhiệt độ 30oC. Vi khuNn sau khi được nuôi cấy tăng sinh đem ly tâm ở 7.000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút. Loại bỏ phần dịch nổi thu vi khuNn, rửa qua nước muối sinh lý 3 lần. Pha loãng vi khuNn bằng nước muối sinh lý, mật độ vi khuNn ban đầu được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng OD600nm sau đó kiểm tra lại bằng phương pháp pha loãng và định lượng trên đĩa thạch.
Các thí nghiệm được bố trí gây nhiễm với các chủng vi khuNn trong điều kiện nhiệt độ và độ mặn cao. Gây nhiễm 2 chủng vi khuNn V. parahaemolyticus, V.
alginolyticus trong điều kiện nhiệt độ 33oC, độ mặn 33‰ (theo hình2.6) và nhiệt độ 35oC, độ mặn 35‰ (theo hình2.7).
NT 1 Đối chứng 1 (-) Ngao (n=3x10) Ngao (n=3x10) V. parahaemolyticus V. parahaemolyticus (0,2 ml 108 cfu/ml) (0,2 ml 108 cfu/ml) Nhiệt độ 33oC Nhiệt độ 31oC Độ mặn 33‰ Độ mặn 25‰ NT 2 Đối chứng 2 (-) Đối chứng (+)
Ngao (n=3x10) Ngao (n=3x10) Ngao (n=3x10)
V. alginolyticus V. alginolyticus PBS (0,2ml) (0,2 ml 108 cfu/ml) (0,2 ml 108 cfu/ml) Nhiệt độ 33oC
Nhiệt độ 33oC Nhiệt độ 31oC Độ mặn 33‰ Độ mặn 33‰ Độ mặn 25‰
Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm gây nhiễm vi khuẩn cho ngao trong điều kiện đa nhân tố nhiệt độ 33°C và độ mặn 33‰
Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm gây nhiễm vi khuẩn cho ngao trong điều kiện đa nhân tố nhiệt độ 35°C và độ mặn 35‰
Gây nhiễm cho ngao bằng phương pháp tiêm, sử dụng dao mỏng bằng nhựa cứng, mở nhẹ miệng ngao vừa đủ đưa đầu kim tiêm. Bơm 0,2 ml dịch huyền phù vi khuNn có nồng độ 108 cfu/ml cho mỗi cá thể ngao ở các nghiệm thức thí nghiệm và đối chứng (-); tiêm 0,2 ml nước muối sinh lý/ngao ở các lô đối chứng (+). Sau khi gây nhiễm đặt ngao trên bề mặt đáy cát trong bể thí nghiệm trong thời gian 30 phút trước khi chế nước mặn ngập bề mặt cát 10 cm.
Với các nghiệm thức nhiệt độ cao, mỗi nghiệm thức gồm 3 xô bằng nhựa đường kính 25 cm, được đặt trong bể lớn composite đường kính 80 cm có chứa mức nước 4 cm. Thiết bị nâng nhiệt sử dụng bằng sục đun nước, đặt ở trong bể lớn. Nhiệt ở bể lớn truyền cho 3 bể nhỏ, trong các bể nhỏ có chứa đầu cảm biến được cài đặt ở nhiệt độ xác định, khi nhiệt độ lên tới mức cài đặt thì nguồn điện sẽ tự động ngắt, sục điện sẽ ngừng hoạt động. Với các nghiệm thức độ mặn cao sẽ tiến hành điều chỉnh độ mặn bằng cách bổ xung nước ót. NT 1-1 Đối chứng 1 (-) Ngao (n=3x15) N gao (n=3x15) V. parahaemolyticus V. parahaemolyticus (0,2 ml 108 cfu/ml) (0,2 ml 108 cfu/ml) Nhiệt độ 35oC N hiệt độ 27oC Độ mặn 35‰ Độ mặn 25‰ NT 2-1 Đối chứng 2 (-) Đối chứng (+)
Ngao (n=3x15) N gao (n=3x15) Ngao (n=3x15)
V. alginolyticus V. alginolyticus PBS (0,2ml) (0,2 ml 108 cfu/ml) (0,2 ml 108 cfu/ml) Nhiệt độ 35oC
Nhiệt độ 35oC N hiệt độ 27oC Độ mặn 35‰ Độ mặn 35‰ Độ mặn 25‰
Độ pH của các nghiệm thức dao động trong khoảng 7,0-8,0 (đo lúc 14:00 hàng ngày) trong suốt quá trình thí nghiệm. Duy trì chếđộ sục khí vừa phải, bổ sung thức ăn tự nhiên 2 ngày/lần bằng tảo Chlorella sp mật độ 104 tb/lít đểđảm bảo dinh dưỡng cần thiết cho ngao.
Hàng ngày kiểm tra các xô thí nghiệm để phát hiện ngao chết để loại bỏ, phân lập vi khuNn từ ngao yếu.
2.4.5. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
- Số liệu vi khuNn được thu thập trong quá trình phân lập và định danh tại phòng thí nghiệm - Trung tâm Quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản miền Bắc - Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1- Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh.
- Số liệu được nhập và biểu đồ tỷ lệ chết cộng dồn được vẽ trên Excel Microsoft Office 2010.
- Công thức tính tỷ lệ nhiễm vi khuẩn:
Trong đó:
X (%): tỷ lệ phần trăm tôm bị nhiễm. A: Số mẫu tôm bị nhiễm.
B: Số mẫu tôm kiểm tra.
- Công thức tính tỉ lệ chết:
N gao gây nhiễm bị chết
Tỉ lệ chết (%) = x 100 Số ngao thí nghiệm X (%) = A B 100 x
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong những năm gần đây, hiện tượng ngao chết hàng loạt xảy ra ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam như Thái Bình, Nam Định, Hải Phòng, Thanh Hóa gây ra tổn thất kinh tế lớn cho người chăn nuôi ngao. Hiện tượng ngao chết hàng loạt thường xảy ra vào khoảng từ tháng 5-7 hàng năm, có nhiều nguyên nhân gây chết ngao như ảnh