3.2.1. Dụng cụ, thiết bị
a. Dụng cụ:
- Đĩa Petri, ống nghiệm, ống đong, cối nghiền mẫu - Bình Erlenmeryer 100-500-mL
- Que cấy, đèn cồn, lame và lamelle, kẹp - Các loại tuýp 1,5-mL, 2-mL
- Đầu col xanh, vàng, trắng
b. Thiết bị:
- Máy đo OD
- Máy Vortex
- pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ) - Cân điện tử Sartorius (Đức)
- Kính hiển vi Olympus CHT ( Nhật) - Nồi khử trùng nhiệt ướt
- Tủ cấy vi sinh vật (Pháp)
- Tủủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức)
- Tủ lạnh -20C Electrolux Confor Plus (Thụy Điển) - Tủ sấy EHRET (Đức)
- Bộ micropipette Gibson, P20, P100, P1000 (Đức) - Máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417C (Đức) - Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)
3.2.2. Nguyên vật liệu
7 mẫu rễ bắp (tách rời rễ thành đoạn 1-1,5cm) được thu từ các huyện (thành phố) ở tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu và 1 mẫu rễ bắp thu ở tỉnh Bình Dương.
3.2.3. Hóa chất a. Hoá chất dùng để khử trùng mẫu - Nước cất vô trùng - Ethanol (cồn) 96% - H2O2 b. Hóa chất dùng để phân lập - Môi trường NFb
Bảng 3: Công thức môi trường NFb (Nguồn: Kirchhof et al., 1997).
Thành phần Hàm lượng (g/l) Acid malic 5 K2HPO4 5 MgSO4.7H2O 0,2 NaCl 0,1 CaCl2 0,02 KOH 4,5 Dd vi lượng(1) 2ml Dd vitamine(2) 1ml Dd FeEDTA 1.64% 4ml
Bromthymol blue 0,5% trong KOH 0,2N 2ml
Agar 18 (môi trường bđ 1,8)
pH 6,8
(1)
Dd vi lượng: Na2MoO4.2H2O: 1g; MnSO4.H2O: 1,5g; H2BO3: 1,4g; CuSO4: 0,4g; ZnSO4.7H2O: 0,12g; Thêm nước cất cho đủ 1000ml
(2)
- Môi trường LGI
Bảng 4: Công thức môi trường LGI (Nguồn:Cavalcante và Dobereiner, 1988).
Thành phần Hàm lượng (g/l) Sucrose 10 KH2PO4 0,6 K2HPO4 0,2 MgSO4.7H2O 0,2 CaCl2 0,02 FeCl3 0,01 Na2MoO4 0,002
Bromthymol blue 0,5% trong KOH 0,2N 5ml
Agar 18 (môi trường bđ 1,8)
pH 5,5
c. Hoá chất kiểm tra khả năng hòa tan Lân
- Môi trường NBRIP
Bảng 5: Công thức môi trường NBRIP (Nguồn: Nautiyal, 1999).
Thành phần Hàm lượng (g/l) Sucrose 10 (NH4)2SO4 0,1 MgSO4.7H2O 0,25 MgCl2.6H2O 0,5 KCl 0,2
Ca3(PO4)2 (hoặc hydroxy-apatite) 5
Bromothymol blue 0.5% trong KOH 0.2N 5ml
Agar 18
d. Hoá chất kiểm tra khả năng cố định đạm - Môi trường Burk’s không đạm
Bảng 6: Công thức môi trường Burk’s không đạm (Park et al., 2005).
Thành phần Hàm lượng (g/l) Glucose 10 KH2PO4 0,41 K2HPO4 0,52 Na2SO4 0,05 CaCl2 0,2 MgSO4.7H2O 0,1 FeSO4.7H2O 0,005 Na2MoO4 0,0025
Agar 18 (môi trường bđ 1,8)
pH 5,5
3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Thu mẫu
Thu mẫu tại nhiều địa điểm khác nhau, trong mỗi điểm lấy 1-2 cây. Chọn các
cây có màu xanh tươi tốt không do bón đạm, thích hợp nhất là các cây đang giai đoạn
ra hoa, tăng trưởng mạnh. Dùng dao bén xắn xung quanh gốc, không cho đứt rễ.
3.3.2. Xử lí mẫu
Rửa mẫu dưới vòi nước chảy mạnh cho sạch đất, rửa lại 2 lần bằng nước cất, để
ráo tự nhiên. Dùng dao bén tách rời rễ thành từng đoạn nhỏ 1 cm để riêng trong các bọc nilon sạch, bảo quản trong tủ lạnh -5oC nếu chưa phân lập.
3.3.3. Khử trùng mẫu
Mẫu rễ được khử trùng bề mặt như sau: Cho mẫu vào bình tam giác 100 ml, sau
đó cho cồn 96% vào bình tam giác vừa ngập mẫu, lắc nhẹ trong 3 phút, tiếp tục khử
trùng bằng H2O2 3% trong 3 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng 4-5 lần.
3.3.4. Phân lập
100l phần dung dịch trong bên trên và cấy vào các ống nghiệm có chứa môi trường LGI và NFb (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần), sau đó đậy nắp các ống nghiệm lại và
đem ủ khoảng 2-4 ngày.
Sau 2-4 ngày quan sát ống nghiệm thấy có một lớp màng mỏng trên bề mặt môi
trường, đó là dấu hiệu chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh, lần lượt cấy chuyển sang môi trường LGI và NFb đặc. Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa
đèn cồn, chạm nhẹ vào lớp màng mỏng để lấy vi khuẩn trãi lên đĩa chữa môi trường
đặc (đường cấy thứ nhất), tiếp tục vẽ đường cấy thứ hai cắt vuông góc đường cấy thứ
nhất và đường cấy thứ ba cắt vuông góc với đường cấy thứ hai để tách rời khuẩn lạc (giữa các lần vẽ phải khử trùng que cấy) và ủ ở 30oC. Sau 1-2 ngày chọn những khuẩn lạc rời, đều nhau nằm trên đường cấy, cấy chuyển sang môi trường khác cho đến khi
quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng. Sau đó chuyển mẫu đã ròng vào ống nghiệm chứa môi trường đặc ủ cho lên và trữở -5oC.
3.3.5. Quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc
Khi cấy chuyển vi khuẩn trên môi trường phân lập đặc ta đồng thời tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng,
độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Tuy nhiên đối với các dạng khuẩn lạc
có kích thước quá nhỏ thì ta sử dụng kích lúp để quan sát.
3.3.6. Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự
chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp.
- Chuẩn bị mẫu vi khuẩn
- Nhỏ 15 µl nước cất vô trùng lên kính mang vật (lame) - Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội
- Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên kính mang vật
- Đậy kính đậy vật (lammelle) lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với lame một góc 45o rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho mẫu vật không có bọt khí.
- Tiến hành quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần để thấy được hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn.
3.3.7. Xác định đặc tính của các dòng vi khuẩn phân lập được a. Khả năng cố định đạm
Tiến hành nhân giống vi khuẩn trên môi trường NFb và LGI trong các ống nghiệm.
Hút 1 ml mẫu vi khuẩn sau khi nhân giống cho vào 20 ml Môi trường Bruk’s
không đạm lỏng trong trong các ống fancol, để trên máy lắc tốc độ 120 vòng/phút, nuôi trong 8 ngày mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần cùng với đối chứng (không chủng vi khuẩn).
Lấy mẫu vào các thời điểm 2, 4, 6, và 8 ngày để xác định hàm lượng ammonium (NH4+) vi khuẩn tổng hợp được bằng phương pháp so màu Oniani.
Ion NH4+ trong dung dịch sẽ phản ứng với phenol dưới sự hiện diện của ion hypocholoride trong môi trường kiềm tạo thành indophenol có màu xanh lá cây. Chuẩn bị hoá chất đo đạm:
- Phenol nitroprusside: Cân 7g phenol và 34mg nitroprusside, thêm 100 ml nước cho vào cốc, cho vào chai (trữ lạnh).
- Sodium hypochloride: Cân 1,48g NaOH cho vào 75 ml nước, khuấy tan và bổ sung 4,98g Na2HPO4, sau đó cho 20 ml NaOCl và cho nước vào đủ 100 ml.
- EDTA: Cân 6g EDTA và bổ sung cho đủ 100 ml nước. - Dung dịch chuẩn NH4+ 1 mg/l.
Tiến hành dựng đường chuẩn đo đạm
Bảng 7: Đường chuẩn đo đạm.
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
NH4+ chuẩn 0ml 0,5ml 1ml 1,5ml 2ml 2,5ml
EDTA 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml
Phenol nitroprusside 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
Đo mẫu
- Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn cho vào eppendof, ly tâm 12000 vòng/phút/5phút.
- Sau đó hút 0,5 ml dịch sau ly tâm cho vào ống nghiệm có chứa 2 ml H2O khử
khoáng, kế đến bổ sung 0.5 ml EDTA, 1 ml Phenol-nitroprusside và 2 ml sodium hypochloride, vortex và để ổn định khoảng 15 phút tiến hành đo OD bước sóng 636 nm (OD636nm)
- Dựa vào phương trình đường chuẩn: Y= a*x + b
Trong đó: x là nồng độ của mẫu (mg/l)
Y là độ hấp thụ quang.
Sau đó, đo độ hấp thụ quang của mẫu cần phân tích để tính hàm lượng NH4+ theo công thức: x= (y – b)/a.
b. Khả năng hòa tan lân
Tiến hành nhân giống vi khuẩn trên môi trường NFb và LGI lỏng trong các ống nghiệm.
Hút 1 ml mẫu vi khuẩn sau khi nhân giống cho vào 20 ml môi trường NBRIP trong trong các ống fancol, để trên máy lắc tốc độ 120 vòng/phút, nuôi trong 20 ngày mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần cùng với đối chứng (không chủng vi khuẩn).
Lấy mẫu vào các thời điểm 5, 10, 15, và 20 ngày để khảo sát khả năng hoà tan
lân khó tan của các dòng vi khuẩn bằng phương pháp so màu Oniani. Hàm lượng P2O5 được hoà tan trong môi trường tác dụng với amoniummolypdate trong môi trường acid tạo thành chất phosphomolypdate màu vàng. Dưới sự hiện diện của chất khử Mo6+ bị khử thành Mo3+ làm cho dung dịch có màu xanh
dương. Màu xanh dương chỉ thị vi khuẩn có khả năng hoà tan lân.
Chuẩn bị hoá chất đo lân:
- Dung dịch A:
(1): Cân 12 gam (NH4)6MO24.4H2O (amoniummolypdate), sau đó thêm 250
H2O vào cốc và khoấy tan.
(2): Cân 0,2908 gam KsbOC4H2O6 (potassium antymonyl tartrate), sau đó thê
(3): Thêm H2O vào cốc có chứa 140 ml H2SO4 đậm đặc cho đủ lượng 1lít. (4): Trộn chung hỗn hợp (1), (2), (3), sau đó thêm H2O đủ lượng 2 lít. - Dung dịch B: Cân 1,050 g acid ascorbic vào cốc, thêm 200 ml dung dịch A. Tiến hành dựng đường chuẩn đo lân
Bảng 8: Đường chuẩn đo lân.
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Nước khử khoáng 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml P2O5 Chuẩn (1mg/l) 0ml 0,5ml 1ml 1,5ml 2ml 2,5ml Dung dịch B 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml Nước khử khoáng 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml Đo mẫu
- Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn cho vào eppendof, ly tâm 12000 vòng/phút/5phút.
- Hút 0,5 ml dịch sau ly tâm cho vào ống nghiệm có chứa 5 ml H2O khử khoáng, sau
đó bổ sung 4 ml dung dịch B và 3 ml H2O khử khoáng, voxtex hỗn hợp, để ổn định khoảng 15 phút tiến hành đo OD bước sóng 880 nm.
c. Khả năng tổng hợp IAA
Tiến hành nhân giống vi khuẩn trên môi trường NFb và LGI lỏng trong các ống nghiệm.
Hút 100 µl mẫu vi khuẩn sau khi nhân giống cho vào 2 ml môi trường NFb và LGI có và không có bổ sung tryptophan trong các effendof (2 ml), để trong bóng tối, nuôi trong 8 ngày mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần cùng với đối chứng (không chủng vi khuẩn).
- Lấy mẫu vào các thời điểm 2, 4, 6, và 8 ngày để xác định hàm lượng IAA vi khuẩn tổng hợp được bằng phương pháp so màu Salkowsky ở bước sóng 530 nm. IAA
được tạo ra trong dung dịch sẽ phản ứng với thuốc thử tạo thành dung dịch có màu hồng xậm tùy thuộc vào IAA do vi khuẩn tạo ra.
Chuẩn bị thuốc thử Salkowsky
- Đong 533 ml H2SO4 đậm đặc vào bình đựng chuẩn, thêm từ từ nước cất vào đủ
1 lít, để nguội sau 12 giờ được dung dịch H2SO4 đậm đặc.
- Cân 4,5 gam FeCl3 cho vào cốc, thêm từ từ dung dịch H2SO4 đậm đặc 10.8 M vào cốc và khoấy cho FeCl3 tan đều, để nguội. Bảo quản trong chai xậm màu. Tiến hành dựng đường chuẩn đo IAA
Bảng 9: Đường chuẩn đo IAA.
Ống nghiệm 0 1 2 3 4
Nước khử khoáng 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
Thuốc thử 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml
IAA chuẩn 0µl 2µl 4µl 6µl 8µl
Đo mẫu
- Lấy mẫu ở các thời điểm 2, 4, 6, và 8 ngày sau khi nuôi, ly tâm 12000 vòng/phút/5 phút.
-Sau khi ly tâm hút 0,5 ml lấy dịch vi khuẩn vào ống nghiệm có chứa 0,5 ml H2O khử khoáng và 1 ml thuốc thử Salkowki đểổn định khoảng 15 phút trong tối, tiến
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập và đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập được
4.1.1. Phân lập
Từ 7 mẫu rễ bắp thu ở tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu và 1 mẫu rễ bắp thu ở tỉnh Bình
Dương đã phân lập được 47 dòng vi khuẩn. Trong số 47 dòng vi khuẩn đã phân lập, có 42 dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ bắp ở tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu (25 dòng NFb và 17 dòng LGI) và 5 dòng phân lập được từ mẫu rễ bắp ở tỉnh Bình Dương (3 dòng NFb và 2 dòng LGI).
Bảng 10: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập được.
STT
Vi khuẩn Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn
Môi trường
1 VRN1a Xã Kim Long, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
2 VRN1b Xã Kim Long, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
3 VRN1c Xã Kim Long, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
4 VRN1d Xã Kim Long, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
5 VRN1e Xã Kim Long, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
6 VRN1f Xã Kim Long, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
7 VRN1g Xã Kim Long, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
8 VRN3a Xã Đá Bạc, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
9 VRN3b Xã Đá Bạc, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
10 VRN4a Xã Suối Rao, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
11 VRN4b Xã Suối Rao, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
12 VRN4c Xã Suối Rao, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
13 VRN6a Xã nghĩa thành, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-VũngTàu NFb
14 VRN6b Xã nghĩa thành huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-VũngTàu NFb
15 VRN2a Xã Hòa Bình, huyện Xuyên Mộc, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
16 VRN2b Xã Hòa Bình, huyện Xuyên Mộc, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
17 VRN2c Xã Hòa Bình, huyện Xuyên Mộc, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
18 VRN2d Xã Hòa Bình, huyện Xuyên Mộc, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
19 VRN2e Xã Hòa Bình, huyện Xuyên Mộc, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
20 VRN5a Thành phố Bà Rịa, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
23 VRN5d Thành phố Bà Rịa, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
24 VRN7a Xã Long Tân, huyện Đất Đỏ, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
25 VRN7b Xã Long Tân, huyện Đất Đỏ, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
26 BRN1a Xã Lai Uyên, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương NFb
27 BRN1b Xã Lai Uyên, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương NFb
28 BRN1c Xã Lai Uyên, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương NFb
29 VRL1a Xã Kim Nông, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu LGI
30 VRL1b Xã Kim Nông, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu LGI
31 VRL1c Xã Kim Nông, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu LGI
32 VRL3a Xã Đá Bạc, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu LGI
33 VRL3b Xã Đá Bạc, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu LGI
34 VRL3c Xã Đá Bạc, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu LGI
35 VRL4a Xã Suối Rao, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu LGI
36 VRL4b Xã Suối Rao, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu LGI
37 VRL4c Xã Suối Rao, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu LGI
38 VRL6a Xã nghĩa thành, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-VũngTàu LGI 39 VRL6b Xã nghĩa thành, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-VũngTàu LGI 40 VRL6c Xã nghĩa thành, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-VũngTàu LGI
41 VRL2a Xã Hòa Bình, huyện Xuyên Mộc, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu LGI
42 VRL2b Xã Hòa Bình, huyện Xuyên Mộc, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu LGI
43 VRL7a Xã Long Tân, huyện Đất Đỏ, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu LGI
44 VRN7a Xã Long Tân, huyện Đất Đỏ, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
45 VRN7b Xã Long Tân, huyện Đất Đỏ, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu NFb
46 BRL1a Xã Lai Uyên, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương LGI
47 BRL1b Xã Lai Uyên, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương LGI
4.1.2. Đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập được
Các dòng vi khuẩn đã phân lập được quan sát dưới kính hiển vi để mô tả đặc điểm tế bào. Các đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập cũng được tiến hành mô tả trên môi trường phân lập (NFb và LGI) sau 2 ngày cấy.
Bảng 11: Đặc điểm các dòng vi khuẩn nội sinh đã phân lập.
Đặc điểm tế bào Đặc điểm khuẩn lạc
STT Vi khuẩn Hình dạng Chuyển
động Màu sắc Hình dạng Dạng bìa Độ nổi ĐK
1 VRN1a Que ngắn + Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 5