3.1. Đối t−ợng nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên đàn gà đẻ bố mẹ L−ơng Ph−ợng,
ISA Brown, Ai Cập, gà siêu thịt ISA, CP 707, Cobb 202, Rode 308, đ−ợc
nuôi tại các trang trại chăn nuôi tập trung với quy mô lớn ở một số x1 thuộc huyện Hoài Đức, huyện Thanh Oai, huyện Quốc Oai, huyện Ch−ơng Mỹ, huyện Ba Vì, tỉnh Hà Tây.
Các đàn gà này đều đ−ợc nuôi theo ph−ơng thức công nghiệp, nguồn gốc thức ăn là những thức ăn công nghiệp.
N−ớc là n−ớc giếng khoan, n−ớc m−a, n−ớc máy, n−ớc giếng khơi…tuỳ theo điều kiện của từng trang trại chăn nuôi.
Công tác phòng bệnh rất đ−ợc trú trọng, một số trang trại gà đ−ợc phòng bệnh cẩn thận mắc bệnh ít hơn. Bệnh chủ yếu xảy ra ở những trang trại
gà không đựơc phòng bệnh hoặc phòng bệnh không theo quy trình. 3.2. Phạm vi nghiên cứu
- Thời gian : 9/2006 - 10/2007 - Địa điểm:
• Một số trại gà chăn nuôi tập trung với quy mô lớn ở Hà Tây.
• Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý - Khoa Thú y - Tr−ờng ĐHNNI Hà Nội.
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Khảo sát bệnh Newcastle ở gà.
- Khảo sát tỷ lệ gà nhiễm Newcastle ở một số trang trại nuôi tập trung với quy mô lớn tại Hà Tây
- Khảo sát tỷ lệ gà nhiễm Newcastle ở các lứa tuổi
- Khảo sát biến động kháng thể của gà đ−ợc tiêm các loại vacxin khác nhau.
3.3.2. Một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Newcastle ở gà. • Xác định các triệu chứng lâm sàng chủ yếu ở gà mắc Newcastle
• Xác định các biến đổi bệnh tích đại thể chủ yếu ở gà mắc Newcastle.
• Nghiên cứu bệnh tích vi thể các cơ quan của gà bệnh: (N1o, tuyến tuỵ, phổi, gan, lách, thận, ruột, dạ dày tuyến, túi fabricius)
• Nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học của gà bệnh 3.4 Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.4.1 Chuẩn bị
- Chọn những đàn gà ở các lứa tuổi khác nhau trong cùng thời gian nuôi, cùng chế độ ăn uống và cách quản lý, chăm sóc nh− nhau để tiến hành theo dõi.
- Ghi sổ nhật ký hàng ngày, lập bảng theo dõi.
3.4.2 Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của gà mắc bệnh Newcastle.
Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng
Chúng tôi tiến hành theo dõi th−ờng xuyên, đồng thời lập phiếu điều tra các bệnh th−ờng gặp ở gà (Phiếu điều tra in ở cuối báo cáo) và đ−a tới tận tay các chủ trang trại chăn nuôi gà với quy mô lớn tại một số x1 thuộc các huyện Hoài Đức, Thanh Oai, Ch−ơng Mỹ, Quốc Oai, Ba Vì, tỉnh Hà Tây.
bệnh, chúng tôi cố gắng nhanh nhất có mặt tại cơ sở để tiến hành chẩn đoán: Căn cứ vào triệu chứng lâm sàng kết hợp với việc tiến hành mổ khám để theo dõi bệnh tích đại thể của gà.
Tiến hành mô khám gà bệnh:
- Mổ khám vùng miệng, hầu, họng, thực quản, khí quản. - Mổ khám diều.
- Mổ khám dạ dày, ruột.
- Mổ khám lách, thận, phổi, gan, tim, túi Fa,... - Tách n1o.
3.4.3 Ph−ơng pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng Parafin, nhuộm Haematoxylin – Eosin (HE):
a) Chuẩn bị:
- Dụng cụ, hoá chất: ống nghiệm, lọ chứa formol 10%, dao, kéo, panh kẹp, cốc đựng hoá chất, phiến kính, máy đúc Block, khuôn đúc, tủ ấm 560C, tủ ấm 370C, máy cắt mảnh Microtom, đèn cồn, n−ớc trứng để t1i mảnh, cồn, xylen, parafin đ1 nấu với sáp ong, thuốc nhuộm HE…
- Lấy bệnh phẩm: Bệnh phẩm là n1o, thực quản, dạ dày tuyến, dạ dày cơ, ruột, túi Fa, gan, phổi, tim, lách, thận, tuyến tuỵ.
b) Cố định tổ chức: (mục đích để giết chết tổ chức)
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%, để sau 10 ngày là có thể sử dụng đ−ợc.
c) Vùi bệnh phẩm: (tạo ra chất nền cho tổ chức dễ cắt)
Tiến hành lần l−ợt các b−ớc sau: + Rửa formol
Lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành các miếng tổ chức theo chiều dài có độ dài 4 – 5mm. Đem rửa trong n−ớc chảy nhẹ 24giờ, để rửa sạch formol. + Khử n−ớc: Cho qua hệ thống thử gồm 5 lọ cồn Cồn 900I : 14 giờ Cồn 900II : 1 giờ Cồn 1000I : 1 giờ Cồn 1000II : 1 giờ Cồn 1000III : 3.5 giờ Mục đích để khử hết n−ớc ra khỏi tổ chức. + Khử cồn: Cho qua hệ thống Xylen gồm 3 lọ
Xylen 1: 2.5 giờ Xylen 2 : 1 giờ Xylen 3: 1 giờ
Mục đích để khử hết n−ớc ra khỏi tổ chức.
Yêu cầu: Khi nào miếng tổ chức trong nh− cục thạch là đ−ợc. Nếu để quá lâu tổ chức sẽ ròn, dễ vỡ và khó cắt.
+ Khử Xylen: Cho qua hệ thống Parafin đ1 ổn định (parafin có từ 3 – 5% sáp ong đ1 nấu, đảo nhiều lần thành một môi tr−ờng đồng nhất ổn định, đặc, chắc không có lẫn tạp chất). Gồm có 4 lọ:
Lọ 1: Parafin + Xylen với tỷ lệ 1:1 (ở 370C) : 14 giờ Lọ 2: Parafin I (ở 560C) : 3 giờ Lọ 3: Parafin II (ở 560C) : 3,5 giờ
Lọ 4: Parafin III (ở 560C) : 3,5 giờ
Mục đích: để khử hết Xylen trong tổ chức. Trong tổ chức chỉ còn parafin thấm đều trong các kẽ mô bào.
Nếu để ở nhiệt độ > 560C thì tổ chức sẽ ròn và dễ vỡ, khó cắt mảnh.
d) Đúc Block:
Mục đích: Để vùi miếng tổ chức trong môi tr−ờng parafin thuần nhất tạo thành một thể thống nhất.
Chuẩn bị: Máy đúc Block, mày làm nguội Block, khuôn Block (khuôn giấy), parafin..
Ph−ơng pháp tiến hành.
- Tháo tổ chức ra khỏi dây xâu theo thứ tự trong ngăn chứa parafin lỏng. - Đổ parafin lỏng vào khuôn, dùng kẹp hơ nóng nhúng nhanh vào ngăn để tổ chức trong parafin lỏng gắp miếng tổ chức ra theo thứ tự đặt vào khuôn. Đặt sao cho vào chính giữa, để cho miếng tổ chức nằm ngang theo ý muốn. Sau đó đặt khuôn đ1 đúc sang bàn lạnh của máy làm nguội Block. Để nguọi từ từ đến khi đông cứng, đặc và chắc là đ−ợc.
- Bóc khuôn, chỉnh sửa lại block cho vuông vắn rồi gắn nh1n, tránh nhầm lẫn.
e) Cắt dán mảnh:
- Chuẩn bị: Máy cắt, dao cắt, đèn cồn, n−ớc trứng, phiến kính, panh kẹp.. - Cắt mảnh: cắt bằng mắy Microtom với độ dàn mảnh cắt khoảng 3 - 4àm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phàn tổ chức là đ−ợc.
- T4i mảnh: (dán mảnh). Mục đích để dán mảnh cắt lê phiến kính. Sau khi cắt đ−ợc, lấy một phiến kính trong sáng, không x−ớc, sạch sẽ. Nhỏ lên đó
4 – 5 giọt n−ớc trứng đ1 pha. Đặt mảnh cắt sao cho nổi lên mặtn−ớc trứng. Sau đó miết phiến kính trên miếng đồng đ−ợc nung nóng bằng ngọn lửa đèn cồn từ 2 đến 3 lần, mỗi lần khoảng 30 giây để cho phần n−ớc trứng nóng dần lên khoảng 560C. Khi lấymảnh cắt duỗi thắng ra, không bị rữa, không bị rách, chảy ra là đ−ợc. Để nghiêng cho hết n−ớc, rồi bỏ tủ ấm 370C (ít nhất là 30 phút) là có thể đem nhuộm đ−ợc.
f) Nhuộm tiêu bản: (theo ph−ơng pháp nhuộm kép bằng thuốc nhuộm
Hematoxilin – Eosin). Các b−ớc nhuộm nh− sau:
- Tẩy Parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống gồm 3 lọ Xylen Xylen 1 : 3 – 5 phút
Xylen 2 : 3 – 5 phút Xylen 3 : 3 – 5 phút
- Tẩy Xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống gồm 3 lọ cồn ethylic Lọ 1 - cồn 1000 I : 1 phút
Lọ 1 - cồn 1000 II : 1 phút Lọ 1 - cồn 900 : 1 phút - Nhuộm Hematoxilin (nhuộm nhân)
Khi nhắc tiêu bản ra khỏi cồn 900, đem rửa qua n−ớc cất rồi lau khô xung quanh tiêu bản, nhỏ Hematoxilin ngập tiêu bản. Để trong vòng 8 - 10 phút, sau đó đổ thuốc nhuộm đi, rửa qua n−ớc chảy 3 - 5 phút cho hết Hematoxilin thừa. Đem lau sạch n−ớc xung quanh tiêu bản và vẩy khô đi. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản có màu xanh tím là đ−ợc.
+ Nếu đậm quá thì nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 960 + HCl tỷ lệ HCl là 1%) trong 30 giây.
Sau khi điều chỉnh màu ta rửa sạch tiêu bản bằng n−ớc cất. - Nhuộm Eosin (Nhuộm bào t−ơng)
Nhỏ eosin ngập tiêu bản 5 - 10 phút tuỳ theo thực tế màu eossssin. Sau đó rửa n−ớc chảy 3 - 5 phút cho hết eosin thừa.
- Tẩy n−ớc: Cho qua hệ thống cồn Cồn 700 trong 15 giây Cồn 900 trong 15 giây Cồn 1000 I trong 15 giây Cồn 1000 II trong 15 giây - Tẩy cồn làm trong tiêu bản:
Cho tiêu bản qua Xylen I: 1 - 2 phút sau đó cho qua Xylen II (để trong tủ ấm 370 C) trong 2 phút (có thể lâu hơn).
g) Gắn Baume canada:
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn Xylen trên tiêu bản. ấn nhẹ để dồn hết bọt khí ra ngoài.
h) Kết quả, đánh giá:
Đem soi lên kính hiển vi quang học với vật kính 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tím, bào t−ơng bắt màu đỏ t−ơi, tiêu bản trong sáng, không có n−ớc, không có bọt khí là đ−ợc.
Nhỏ Eosin ngập trên tiêu bản 1 - 2 phút, đổ thuốc nhuộm, rửa n−ớc vẩy khô, soi kính.
3.4.4 Ph−ơng pháp đếm hồng cầu, bạch cầu bằng buồng đếm Newbauer:
- Chuẩn bị: Buồng đếm hồng - bạch cầu Newbauer, dung dịch pha
lo1ng hồng bạch cầu (chung cho cả đếm hồng cầu và bạch cầu), ống pha lo1ng hồng bạch cầu, kính hiển vi quang học, la men, cồn bông,
a) Đếm hồng cầu
- Hút máu vào ống pha lo1ng đến vạch 0,5, dùng bông lau sạch bên ngoài. - Lập tức hút tiếp dung dịch pha lo1ng vừa đủ đến vạch 101.
- Lấy ống cao su ra rồi lấy ngón tay bịt kín 2 đầu ống lại đảo nhẹ cho máu trộn đều.
- Đậy lamen lên buồng đếm, nhỏ dung dịch pha (tr−ớc khi nhỏ phải bỏ đi 1 - 2 giọt đầu). Đợi 2 - 3 phút sau cho hồng cầu ổn định, ta bắt đầu đếm.
- Cách đếm:
Đếm 5 ô trung bình, mỗi ô trung bình có 16 ô nhỏ ở 4 vị trí góc và chính giữa. Khi đếm, ta đếm lần l−ợt theo hình chữ Z, chỉ đếm những hồng cầu phía trong, nằm trên cạnh trên và cạnh bên phải ô nhỏ.
- Cánh tính:
Gọi M là số hồng cầu đếm đ−ợc ở 5 ô trung bình thì số hồng cầu trong 1mm3 là M x 10.000
b) Đếm bạch cầu:
- Hút máu vào ống pha lo1ng đến vạch 0,5. - Hút dung dịch pha lo1ng đến vạch 11.
- Bỏ ống cao su ra dùng tay bịt kín 2 đầu, lắc nhẹ cho máu trộn đều. - Đậy lamen lên buồng đếm, nhỏ một giọt dung dịch pha lo1ng, sau khi
- Cách đếm:
Đếm trong ô vuông lớn ở giữa hay 25 ô trung bình hay 400 ô vuông con. - Cách tính:
Gọi số bạch cầu đếm đ−ợc trong 4 ô là N thì số l−ợng bạch cầu có trong 1mm3 là N x 2000.
3.4.5 Ph−ơng pháp làm huyết sắc tố Shalli
- Nguyên tắc:
Cho axit HCl vào máu sẽ kết hợp với huyết sắc tố tạo thành Hematin màu nâu, sau đó so màu với ống chuẩn.
- Thuốc thử: HCl 0,1N hoặc 1%. - Thao tác:
Cho dung dịch HCl 0,1N vào ống đến vạch 10. Dùng máu hút đến vạch 20. Dùng bông lau sạch những vết máu ngoài ống. Cho ống hút xuống tận đáy ống đo thổi nhẹ máu xuống ống hút và hút lên thổi xuống nhiều lần để rửa sạch máu trong ống hút rồi trộn đều.
Để 10 phút sau, rồi pha lo1ng từ từ với n−ớc cất đến lúc máu của ống đo và máu của ống chuẩn bằng nhau thì thôi. Đọc kết quả trên cột số, đó là số gam huyết sắc tố trong 100ml máu.
• Chú ý:
Nếu pha lo1ng dung dịch quá sớm, kết quả định l−ợng sẽ sai. Nếu cho máu vào chỉ 1 phút sau pha lo1ng, kết quả chỉ bằng 75% so với thực tế vì chỉ có 75% huyết sắc tố chuyển thành Hematin, nếu 5 phút sau pha lo1ng thì có 88% và 2 gời sau là 100%. Sau 10 phút pha lo1ng, chỉ có 90% l−ợng huyết sắc tố chuyển thành màu nâu. Những ống mẫu của bộ huyết sắc kế Shalli đ1 đ−ợc ph trong điều kiện đó.
- Sau mỗi lần đo phải rửa sạch bằng n−ớc cất. - Đơn vị tính: gr%.
3.4.6 Ph−ơng pháp Hematocrit - Dụng cụ:
Máy ly tâm TH - 12, ống ly tâm, th−ớc đọc kết quả, sáp ong bịt ống ly tâm.
- Cách làm:
Lấy máu chống đông vào ống Hematocrit sao cho l−ợng máu hút vào phải đều nhau và không có lẫn bọt khí ở trong, bịt kín một đầu ống bằng sáp ong khoảng 1 - 2mm đem đặt vào máy ly tâm sao cho đối xứng nhau (đặt các đầu bịt sáp ong h−ớng ra ngoài), ly tâm với vận tốc 3000 vòng/phút trong vòng 10 - 15 phút. Sau đó lấy ra đem so trên th−ớc để đọc kết quả.
- Đơn vị tính: %.
- Thể tích bình quân hồng cầu: đ−ợc tính theo công thức sau:
Tỷ khối hồng cầu (%) Vtb =
Số l−ợng hồng cầu (triệu/mm3) x 10
- L−ợng huyết sắc tố (Hemoglobin) bình quân hồng cầu: (LHbBQ)
Biểu thị l−ợng huyết sắc tố trong mỗi hồng cầu, đ−ợc tính theo công thức: Hb (%) x 10
LHbBQ =
Số l−ợng hồng cầu (triệu/mm3) Pg Nồng độ huyết sắc tố bình quân hồng cầu: (NĐHbBQ)
Biểu thị tỷ lệ % huyết sắc tố chứa trong 100ml hồng cầu hoặc tỷ lệ % huyết sắc tố so với thể tích mỗi hồng cầu
Hb (%) x 100 NĐHbBQ =
Tỷ khối hồng cầu (%) (%)
- Công thức bạch cầu theo ph−ơng pháp Maegregor trên tiêu bản máu nhuộm giemsa.
3.4.7 Ph−ơng pháp điện di trên phiến Axetat cellulose để xác định các tiểu phần protein huyết thanh.
3.4.8 Ph−ơng pháp xử lý số liệu
Sau khi thu thập số liệu, tổng kết sơ bộ đ−ợc xử lý bằng ph−ơng pháp thống kê sinh học với các tham số và sử dụng ch−ơng trình Excel trên máy vi tính.: - Số trung bình: X = n xi ∑ - Độ lệch chuẩn: Sx = 1 ) ( − − ∑ n x xi
- Sai số của số trung bình
30n n 1 mx ≥ − ± = n S ; n S ± = mx n ≤ 30