Nguyên lý
Kỹ thuật ELISA là phản ứng huyết thanh học dựa vào phản ứng miễn dịch học giữa kháng nguyên và kháng thể chuẩn. Kháng nguyên hoặc kháng thể có trong huyết thanh sẽ được gắn kết với kháng thể hoặc kháng nguyên đã được hấp thụ trong đĩa 96 giếng. Thành phần không gắn kết sẽ bị rữa trôi, phần tiếp tục giữ lại tiếp tục kết hợp với Conjugate (Chất kết hợp) có enzyme peroxidase. Phản ứng chuyển màu (từ không màu sang màu xanh dương) khi có sự tham gia cơ chất Chromagen. Mức độ màu thể hiện ở mỗi giếng tương ứng với hàm lượng kháng thể ở mỗi mẫu xét nghiệm. Máy đọc ở bước sóng phù hợp sẽ xác định được lượng kháng thể hoặc kháng nguyên giữ lại trong giếng.
Phương pháp thực hiện
Tất cả các thuốc thử và bộ kít để ở nhiệt độ phòng, lắc đều các lọ trước khi sử dụng.
Chuẩn bị mẫu
Các mẫu huyết thanh cần kiểm tra được pha loãng 500 lần (1:500) với dung dịch pha mẫu trước khi xét nghiệm (pha 1 µl mẫu với 500 µl dung dịch pha mẫu). Lưu ý: không pha loãng các mẫu đối chứng (âm và dương). Sau đó dùng máy lắc trộn đều mẫu huyết thanh với dung dịch pha mẫu trước khi cho vào đĩa ELISA có gắn kháng nguyên IBD. Bắt đầu với giếng A5 và kết thúc bằng giếng H12 (di chuyển trái sang phải) như hình sau:
Hình 3.1 Sơ đồ bố trí huyết thanh xét nghiệm ELISA
Ghi chú: 1-92 là mẫu cần xét nghiệm, (+): Đối chứng dương, (-) : Đối chứng âm.
17 Quy trình thực hiện phản ứng
1. Cho 100 µl đối chứng dương vào giếng A1 và A2. 2. Cho 100 µl đối chứng âm vào giếng A3 và A4.
3. Cho 100 µl mẫu cần kiểm tra vào mỗi giếng theo sơ đồ 3.1 4. Ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
5. Giũ hết các chất lỏng trong các giếng vào bồn rữa dụng cụ.
6. Cho 350 µl nước cất vào mỗi giếng, sau đó giũ hết các chất lỏng vào bồn rữa dụng cụ, thực hiện lặp lại 3-5 lần.
7. Cho 100 µl Conjugate vào tất cả các giếng. 8. Ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
9. Lặp lại bước 5 và 6.
10. Cho 100 µl dung dịch TMB Substrate Solution vào mỗi giếng. 11. Ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.
12. Cho 100 µl dung dịch Stop Solution vào mỗi giếng để dừng phản ứng.
13. Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 650 nm. Kết quả
Kết quả có giá trị khi sự khác biệt giữa trung bình đối chứng dương và trung bình đối chứng âm (PC ̅ - NC ̅) lớn hơn 0,075. Giá trị OD trung bình đối chứng âm phải nhỏ hơn hoặc bằng 0,150. Sự có mặt hoặc không có mặt của kháng thể kháng Gumboro trong mẫu huyết thanh được xác định dựa vào các giá trị OD đo được ở bước sóng 650nm. Sự tương quan nồng độ kháng thể trong các mẫu xét nghiệm được xác định bằng cách tính toán tỷ lệ dương tính của mẫu (the sample to positive (S/P) ratio).
Mẫu xét nghiệm được kết luận dương tính khi tỷ lệ S/P lớn hơn 0,20 (hiệu giá lớn hơn 396) và âm tính khi tỷ lệ S/P nhỏ hơn hoặc bằng 0,20.
18
Tính toán kết quả - Trung bình đối chứng dương (PC ̅)
Giá trị OD650 giếng A1 + Giá trị OD650 giếng A2 (PC ̅) =
2 - Trung bình đối chứng âm (NC ̅)
Giá trị OD650 giếng A3 + Giá trị OD650 giếng A4 (NC ̅) = 2 - Tỷ lệ S/P (Sample/Positive) OD mẫu - NC ̅ S/P = PC ̅ - NC ̅ - Hiệu giá (Titer)
Log10 Titer = 1,09 (log10 S/P) + 3,36
Titer = 10^[1,09 (log10 S/P) + 3,36]