Trong lãnh vực sinh ho ̣c rất khó khăn do giao thoa.
Nếu tách chất cần đo ra giá thành rất cao, tớn thời gian khơng thể thực hiê ̣n hàng ngày.
Enzyme xúc tác sự chuyển đởi 1 hay 1 số cơ chất thành 1 hay 1 số sản phẩm.
Tỉ lệ của phản ứng xúc tác hay hoa ̣t tính của enzyme cĩ thể được xác định bằng cách đo sự giảm nờng đợ cơ chất hoặc sự tăng nờng đợ sản phẩm.
Khi cơ chất và sản phẩm khác nhau về đơ ̣̣̣ hấp thu, quá trình phản ứng enzyme cĩ thể
được theo dõi bằng cách kiểm sốt sự thay đởi đợ hấp thu theo thời gian.
Quang phổ UV-Vis là một torng những phương pháp tốt nhất để đo tốc độ của phản ứng hĩa học (bằng động học phản ứng):
Xét phản ứng hĩa học: A+BC+D.
Nếu chất A hay B hấp thu trong vùng phổ UV-Vis ở tại bước sĩng 1 hoặc các sản phẩm C hay D hấp thu tại bước sĩng 2 n{o đĩ thì tốc độ của phản ứng này cĩ thể đo được bằng cách:
+ Đo độ giảm hấp thu tại 1 do các chất phản ứng A hay B mất đi từ từ.
+ Đo độgiâ tăng hấp thu tại 2 do các sản phẩm C hay D hấp thu từ từ.
Khi độ hấp thu của chất phản ứng hay của sản phẩm thay đổi thì sẽ tỷ lệ với sự thay đổi nồng độ của các chất xảy ra trong phản ứng.
Phương ph|p n{y được ừng dụng rộng rãi trong định lượng enzyme đã xúc t|c. Trong thực nghiệm, nếu enzyme được chọn lọc cẩn thận thì khi thêm enzyme vào mẫu
chuyên biệt, bất cứ thay đổi hấp thu quang phổ nào ghi nhận được trong mẫu cũng chỉ là do phản
ứng của enzyme này và của mẫu. Khi định lượng enzyme cĩ thể phân biệt 2 thơng số:
Tốc độ phản ứng hĩa học của hoạt tính enzyme, tùy thuộc vào:
+ Nhiệt đợ,
+ pH ++ hoạt tính emzyme nờng đợ enzyme.
Tính chuyên biệt của phân tửcơ chất.
Hiệu số giữa độ hấp thu đầu tiên và cuối cùng sẽ tỷ lệ thuận với số lượng cơ chất cĩ thể phân tích mẫu gián tiếp.
Thí dụ:
Đe ̉ định lượng enzyme, người ta có the ̉ sử dụng phép phân tích gián tiếp mẫu (mo ̣t cha ́t hay mo ̣t nhóm cha ́t).
Ne ́u enzyme này được chọn lọc ca ̉n tha ̣n thì khi the m enzyme vào ma ̃u chuye n bie ̣t, ba ́t cứ thay đo ̉i nào trong ma ̃u cũng sẽ chỉ do phản ứng của enzyme này và của ma ̃u đó.
Sự chọn lọc này là cơ bản đe ̉ định lượng enzyme. Thí dụ: định lượng -chymotrypsin
Cho n-acetyl n- tyrosin ethyl esther vào dung dịch -chymotrypsin rồi đo độ giảm hấp thu của dung dịch trên ở bước sĩng 237nm theo thời gian.
Tình h{m lượng quy về UI. Giảm 0.0075=1UI.
Hĩa phân tích 2 Trần Trung Trực 28
D. CÁC ỨNG DỤNG KHÁC
1- Xác định hằng sớ pKa
a. Mục đích
Nghiên cứu cấu trúc các hợp chất hữu cơ. b. Nguyên tắc
Phở UV-Vis của các chất hữu cơ chứa các nhóm chức cĩ tính acid hay base thường thay đổi theo pH của mơi trường.
Dạng và cường độ của đường cong hấp thu ̣̣ thay đổi theo [H+
]
Thí dụ : HB: acid / nướ c bi ̣̣̣ phân ly HB + H2O H3O+ + B-
B- : base lie n hợp với dung dịch acid loãng HB, ta có:
] [ ] ][ [ HB B H Ka pKa=pH+ ] [ ] [ lg acid base ) ( ) ( lg ] [ ] [ lg A A A A HAc Ac pK HB B Hac
Giá trị pH đo bằng máy đo pH.
Giá trị của tỷ số đo được bằng máy đo quang phổ.
Từ đó tính được pKa
c. Giải thích
Mt thật acid sẽ đo được giá trị hấp thu cực đa ̣i của da ̣ng HB.
Mt thật kiềm sẽ đo được giá trị hấp thu cực đa ̣i của da ̣ng B-
.
Mt trung gian (đệm) đo được giá trị hấp thu cực đa ̣i của cả 2 HB và B-
.
Độ hấp thu đo đươ ̣c sẽ là sự tở hợp tuyến tính của 2 dạng đĩ.
Áp dụng luật cợng tính mật đợ quang d. Ví dụ
Xác định pKa của acid benzoic bằng cách khảo sát đường cong hấp thu ̣̣̣̣̣̣ của acid benzoic
Mơi trường acid H2SO4 0.1N, Mơi trường kiềm NaOH 0.1N,
Mơi trường đe ̣m acetic, acetat (CH3COONa 0.1M, CH3COOH 0.35M)
Giá trị pKa của acid benzoic được tính như sau :
pKa = pH đê ̣m + ] [ ] [ lg base acid ) ( ) ( lg ] [ ] [ lg A A A A HAc Ac pK HB B Hac Dạng phổ UV – vis
của dạng pha n tử ( pH = 2)
của dạng ion hoá (pH =8)
Hĩa phân tích 2 Trần Trung Trực 29
e. Phương pháp khác
Xây dựng đường cong sự phụ thuộc của độ hấp thu A (ở một bước sĩng nhất định) vào pH của dung dịch.
Xác định bằng đồ thị điểm trung bình mà pH=pK nghĩa là [HB]=[B- ]
Đo pH và đo mật độ quang hang loạt dung dịch.
2- Xác định sớ tiểu phân hấp thụ̣̣̣̣̣̣̣̣ trong dung dịch (xác định điểm đẳng quang)
Nếu hai chất với nờng độ bằng nhau / dung dịch và cĩ những dải hấp phu ̣̣̣ xen phủ nhau thì tồn tại một bước sĩng mà ở đĩ hê ̣ sớ hấp thụ̣̣ mol của chúng bằng nhau.
Nếu tởng nờng đơ ̣̣̣ của hai chất / mơ ̣̣̣t dung dịch bằng sớ hằng đi ̣̣̣nh thì dù tỉ sớ nờng đơ ̣̣̣
của chúng thay đởi nhưng sự hấp phụ tại bước sóng nói trên vẫn khơng thay đởi.
Thường gă ̣̣̣p nhất là:
hai cha ́t na ̀m trong mo ̣t ca n ba ̀ng mà đường cong hâ ́p thụ̣̣ củâ chúng giâo nhâu tại mo ̣t bước sóng nào đó.
Giâo điê ̉m đó khơng bị thay đo ̉i khi thay đo ̉i các ye ́u to ́ ảnh hưởng đe ́n ca n ba ̀ng (pH, cha ́t khác).
Nói mo ̣t cách khác trong các trường hợp tre n có tờn tại một bước sóng mà ở đó hệ sớ hấp thụ̣̣ mol củâ
2 châ ́t đó bâ ̀ng nhâu.
Đie ̉m giao nhau tại đó gọi là điê ̉m đâ ̉ng quâng.
Sự cĩ mặt của điểm đẳng quang chứng tỏ trong dung dịch tồn tại ít nhất 2 tiểu phân hấp thu bức xạ.
Ứng dụng: “trong phản ứng hĩa học khi 1 chất X chuyển thành chất Y.”
Nếu phổ của X tinh khiết và Y tinh khiết cắt nhau tại bước sĩng n{o đĩ thì mọi phổ được ghi nhận trong phản ứng hĩa học sẽ đi qua điểm đẳng quang.
Ví dụ: đỏ methyl trong các mơi trường pH khác nhau
pH = 4,5: đỏ methyl là hợp cha ́t màu đỏ/ dung dịch (dạng acid HIn)
pH = 7,1: màu vàng được tạo thành / dung dịch (dạng kiềm In-)
pH = 4,5 -7,1 dung dịch sẽ chứa cả hai dạng acid HIn và dạng kiềm In-
hình cho thấy tất cả phổ của hai dạng ở mọi nờng độca ́t tại mo ̣t đie ̉m.
Khi đó, phương trình ha ́p thụ̣ của dung dịch ở 465nm (co ̣ng tính):
A465 = Hin465 x [HIn] + In465 y[In-]
Hĩa phân tích 2 Trần Trung Trực 30
Phở của Hin tinh khiết và In- tinh khiết ở cùng nồng độ cũng cắt nhau tại bước sĩng 465nm và có phương trình hấp thu ̣̣: A465= 465 ([HIn] + [In-]) (2)
Hình trên biểu diễn phổ hấp thu ̣̣ của mọi dd chứa đỏ metyl ở cùng một nồng độ - nghĩa là tởng nờng đơ ̣̣̣ da ̣̣̣ng acid và kiềm luơn bằng nhau (và = [HIn] + [In-]), chỉ cĩ pH thay đởi Do vâ ̣y, tởng nờng đơ ̣ trong (2) là hằng số (A465 là hằng số). Ý nghĩa: Sự hiê ̣n hữu của điểm đẳng quang trong phản ứng hoá ho ̣c chứng tỏ rằng chỉ cĩ hai chất tinh khiết này hiện diện. Ghi nhớ: “điểm đẳng quang xảy ra khi x = y và tởng [x] và [y] là hằng sớ.” V VIIII--MMỤỤCC LLỤỤCC I- PHẠM VI PHỞ UV-VIS ... 1
II- GỈAI THÍCH SỰ CHUYỂN MỨC NĂNG LƯỢNG ELECTRON TRONG PHỞ UV-VIS ... 1
A. CÁC ĐIỆN TỬ THAM GIA VÀO SỰ HẤP THU UV-VIS ... 1
B. CÁC KIỂU DÃY HẤP THỤ ... 3
1- R-Radikalartig ... 3
2- K-Konjugierto ... 3
3- B-Benzenoid ... 3
4- E-Ethylenic ... 3
C. CÁC ĐẶC TRƯNG ĐỂ MƠ TẢ PHỞ UV-VIS ... 4
1- Vị trí vân phổ ... 4
2- Cường độ vân phổ... 4
3- Hình dáng vân phổ ... 4
III- CÁC YẾU TỚ THAM GIA VÀO SỰ HẤP THỤ CÁC HIỆU ỨNG TRONG PHỞ UV-VIS ... 5
A. MÀU SẮC ... 5
B. NHÓM MANG MÀU(CHROMOPHORE) ... 5
C. NHÓM TRỢ MÀU (AUXOCHROME) ... 6
D. CÁC HIỆU ỨNG VÀ SỰ CHUYỂN DỊCH ... 6
IV- CÁC YẾU TỚ ẢNH HƯỞNG ĐẾN ĐỢ HẤP THỤ̣ ... 7
A. CẤU TRÚC PHÂN TỬ... 7
1- Hiệu ứng cảm ứng I. ... 7
2- Hiệu ứng liên hợp. ... 7
3- Hiệu ứng khơng gian. ... 7
4- Vị trí liên kết đơi ... 7
Hĩa phân tích 2 Trần Trung Trực 31
B. MƠI TRƯỜNG 7
1- Dung mơi ... 8
2- Nồng độ ... 9
3- pH ... 9
a. Ảnh hưởng của pH lên phổ hấp thu ... 9
b. Các ví dụ ... 10
-i- Phenol ... 10
-ii- Anilin ... 11
4- Nhiệt độ ... 12
V- MÁY QUANG PHỞ TỬ NGOẠI - SPECTROPHOTOMETER ... 12
A. CẤU TẠO ... 12
B. PHÂN LOẠI ... 12
1- Loại một chùm tia ... 13
2- Loại hai chùm tia ... 13
C. THẨM ĐỊNH THIẾT BỊ QUANG PHỞ UV-VIS ... 14
1- Độ đúng bước sĩng (phải được chuẩn hĩa về )... 14
2- Phải cho sớ chỉ đúng về đơ ̣ hấp thu ... 15
3- Hình phổ ánh sáng lạc của các dung dịch chuần ... 16
4- Cớc đo ... 16
VI- ỨNG DỤNG ... 17
A. ĐỊNH TÍNH ... 17
1- Các ứng dụng trong định tính ... 17
a. Định tính trong trường hợp khơng có chất chuẩn ... 17
b. Định tính trong trường hợp có chất chuẩn ... 17
c. Kiểm tra đợ tinh khiết – phát hiện tạp chất ... 18
d. Xác định cấu trúc – xác định nhĩm chức ... 18
Hĩa phân tích 2 Trần Trung Trực 32
B. ĐỊNH LƯỢNG ... 20
1- Nguyên tắc định lượng ... 20
2- Phương pháp định lượng ... 20
a. Định lươ ̣ng trực tiếp ... 20
-i- Định lươ ̣ng chất khảo sát có mơ ̣t thành phần ... 20
mơ ̣t) Phương pháp đo tuyê ̣t đới (khơng sử dụng trực tiếp chất chuẩn - máy phải được chuẩn hĩa) ... 20
hai) Phương pháp sử du ̣ng hê ̣ sớ hấp thu ̣̣ mol của mơ ̣t chất ... 21
ba) Phương pháp đo tương đối ( đã cĩ chuẩn) – phương pháp so sánh độ hấp thu ... 21
bớn) Phương pháp dùng đường hời qui chuẩn (xây dựng đường cong chuẩn đơ ̣) ... 21
-ii- Đi ̣nh lượng hởn hợp có nhiều thành phần ... 22
mơ ̣t) Khái niệm về sự chồng phổ ... 22
hai) Phương pháp sử du ̣ng luâ ̣t cơ ̣ng tính mâ ̣t đơ ̣ quang ... 23
ba) Phương pháp sử du ̣ng máy đa kênh (dải diod)... 24
bớn) Phương pháp phở đa ̣o hàm ... 24
b. Định lượng gián tiếp ... 25
-i- Chuẩn đợ đo quang phở ... 25
-ii- Tạo dẫn chất hấp thu ̣̣ mạnh và đo trong vùng UV –vis ... 26
mơ ̣t) Nguyên tắc ... 26
hai) Thí dụ ... 26
ba) Giải thích ... 26
C. NGHIÊN CỨU ĐỢNG HỌC PHẢN ỨNG ... 27
D. CÁC ỨNG DỤNG KHÁC ... 28 1- Xác định hằng số pKa ... 28 a. Mục đích ... 28 b. Nguyên tắc ... 28 c. Giải thích ... 28 d. Ví dụ ... 28 e. Phương pháp khác ... 29
2- Xác định số tiểu phân hấp thu ̣̣̣ trong dung di ̣ch (xác định điểm đẳng quang) ... 29