Sau khi lấy mẫu (phân, gan, thịt, phổi) tiến hành phân lập E. coli sinh ESBL như sau:
Mẫu (phân, gan, thịt, phổi) được cấy lên môi trường thạch MC bổ sung ceftaxidime 2mg/l. Sau đó, ủ ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ. Khuẩn lạc E. coli mọc trên môi trường MC có màu đỏ hồng, tròn, lồi. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy trên môi trường NA, sau 24 giờ tiến hành thử sinh hóa IMViC (++--) để khẳng định vi khuẩn E. coli. Sau đó tiếp tục thực hiện phương pháp đĩa kết hợp trên môi trường MHA để xác định vi khuẩn E. coli sinh beta – lactamase phổ rộng bằng cách dùng que tampon vô trùng nhúng vào huyễn dịch vi khuẩn 108 CFU/ml, ép vào thành ống cho bớt nước rồi phết đều lên mặt thạch. Sau khi mặt thạch khô, ta tiến hành đặt các khoanh giấy kháng sinh như sau:
Đĩa 1A chứa Ceftazidime (Cz) 30µg, đĩa 1B Ceftazidime 30µg + acid clavulanic 10µg (Zc).
Đĩa 2B Cefotaxime (Ct) 30µg, đĩa 2B Cefotaxime 30µg + acid clavulanic (Zt) 10µg. Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 37°C trong 16 – 24 giờ. Nếu có sự khác biệt giữa đĩa 1A, 1B và 2A, 2B lớn hơn 5mm thì khẳng định có vi khuẩn E. coli sinh beta-lactamase phổ rộng.
Hình 3.1. Phương pháp đĩa kết hợp xác định E. coli ESBL
Zc Cz
Ct
17
Hình 3.2 Quy trình phân lập E.coli sinh beta- lactamase phổ rộng
Trước khi cấy vào môi trường MHA lấy vài khuẩn lạc E. coli ESBL cho vào ống nghiệm chứa 9ml muối sinh lý và so với ống nghiệm có độ đục chuẩn Mac Farland 0.5 có chứa 108 CFU/ml.
Mẫu phân, gan, thịt, phổi ủ 370 C /24 giờ MacConkey Agar + Ceftaxidime 2mg/l
Cấy thuần trên NA
ủ 370 C /24 giờ
Thử sinh hóa IMViC (++--). Khẳng định E. coli
Bằng phương pháp đĩa kết hợp
Đĩa 1: Ceftazidime 30 µg, Đĩa 1B: Ceftazidime 30 µg + acid clavulanic 10 µg Đĩa 2: Cefotaxime 30 µg, Đĩa 1B: Cefotaxime 30 µg + acid clavulanic 10 µg
ủ 370 C /24 giờ Khẳng định E. coli sinh ESBL
18