a. Phương pháp chuẩn bị vi khuẩn Bacillus subtilis
Cấy giống vi khuẩn Bacillus subtilis từ Bộ môn Công nghệ sinh học – Trường Đại học An Giang vào hộp Petri. Úp ngược các hộp Petri rồi đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 35 - 400C trong 24 - 48h. Sau thời gian trên ở bề mặt thạch
đĩa sẽ mọc các khuẩn lạc riêng biệt mắt thường quan sát được. Sau đó vi khuẩn Bacillus subtilis được tăng sinh khối trong môi trường dinh dưỡng tối thiểu. Dung dịch vi khuẩn để trong môi trường tự nhiên sau 2 -3 ngày có thể
sử dụng.
Thành phần môi trường vi khuẩnBacillus subtilis ( 0,5 lít) :
+ K2HPO4 : 15g + KH2PO4 : 5g + NH4NO3 : 0,5g + NH4Cl : 2,5g +Na2SO4 : 0,5g + MgSO4.7H2O : 0,05g + MnSO4.4H2O : 0,005g + FeSO4.7H2O : 0,005g + CaCl2 : 0,0025g + Glucose : 5g + L.Glutamic acid: 0,735g + Agar: 9g b. Phương pháp đo pH Xác định pH bằng máy đo pH.
c. Phương pháp xác định BOD5 (Theo SMEWW 5210B-1995 & TCVN 6001-1995)
GVHD: Nguyễn Hữu Thanh
* Hóa chất
- Dung dịch đệm phosphat: hòa tan 8,5g KH2PO4; 21,75g K2HPO4 ; 33g Na2HPO4.7H2O và 17g NH4Cl trong nước cất và pha loãng thành 1 lít.
- Dung dịch MgSO4 22,5g/l: hòa tan 22,5g MgSO4.7H2O trong nước cất và pha loãng thành 1 lít.
- Dung dịch CaCl2 27,5g/L: hòa tan 27,5g CaCl2.2H2O trong nước cất và pha loãng thành 1 lít.
- Dung dịch FeCl3 0,25g/L: hòa tan 0,25g FeCl3.6 H2O trong nước cất và pha loãng thành 1 lít.
- Dung dịch Mangan (II) MnSO4: hòa tan 425g MnCl2.4H2O hoặc 480g MnSO4.4H2O (hoặc 400g MnSO4.2H2O hoặc 364g MnSO4.H2O) trong nước cất và pha loãng thành 1 lít.
- Dung dịch kiềm iodua: hòa tan 75g KI trong 150ml nước cất. Hòa tan 250g NaOH trong 250ml nước cất. Trộn 2 dung dịch lại với nhau và thêm 5g NaN3, rồi pha loãng thành 500ml.
- H2SO4đậm đặc d = 1,84g/ml.
- Dung dịch Na2S2O3 tiêu chuẩn 0,1N: Hòa tan 24,8g Na2S2O3.5H2O và 1g Na2CO3 trong 1 ít nước cất, sau đó pha loãng thành 1 lít.
- Dung dịch Na2S2O3 0,01N: Lấy 50ml dung dịch Na2S2O3 0,1N pha loãng với nước cất thành 500ml.
- Chỉ thị hồ tinh bột 1%: hòa tan 1g hồ tinh bột trong 100mL nước ấm (80o – 90o) khuấy cho đến khi dung dịch trong suốt, cho vào 0,5ml formaline nguyên chất để sử dụng được lâu.
* Chuẩn bị nước pha loãng: Cho vào lần lượt 1ml các dung dịch đệm phosphate; MgSO4;CaCl2; FeCl3 cho mỗi lít nước cất, sục khí liên tục khoảng 2 – 3 giờ (giá trị oxy hòa tan ít nhất phải đạt 7 – 8mg/l). Dung dịch này sử
dụng trong 24 giờ. * Cách tiến hành
Lấy 2 chai nút mài, cho vào mỗi chai 20ml mẫu và nước pha loãng (Vchai = 300ml).
+ Chai 1 đậy thật kín, miệng chai được niêm phong bằng 1 màng nước,
đem ủ 5 ngày ở 200C (DO5) (tủủ BOD), sau đó phân tích như chai 2.
GVHD: Nguyễn Hữu Thanh
+ Chai 2 đem định phân ngay hàm lượng oxy hòa tan ngày đầu tiên (DO0). Xác định hàm lượng oxy hòa tan như sau:
Thêm vào chai 1ml dung dịch MnSO4 và 1ml dung dịch kiềm iodua.
Đậy nắp kín, lắc đều, để kết tủa lắng ổn định. Thêm từ từ 2ml H2SO4 đậm
đặc, lắc cho tan kết tủa. Sau đó lấy 50ml mẫu đem chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3 0,01N với chỉ thị hồ tinh bột 1%.
Công thức tính hàm lượng oxy hòa tan: X (mg/L) = ) 2 300 ( 8000 300 1 − × × × × V N V Trong đó: V1: thể tích Na2S2O3 0,01N đã dùng , ml N: nồng độ Na2S2O3 0,01N V: thể tích mẫu đem chuẩn độ, ml 2: tổng thể tích dung dịch Mn2+ và iodua kiềm. * Tính toán: BOD5 = (DO0 – DO5) * K
Trong đó: DO0: hàm lượng oxy hòa tan đo được ngày đầu tiên, mg/l. DO5: hàm lượng oxy hòa tan đo được sau 5 ngày ủ, mg/l. K: hệ số pha loãng.
d. Phương pháp xác định COD (Theo Nguyễn Văn Phước và cộng tác viên, 2005)
Xác định COD bằng phương pháp bicromat.
- Cho vào ống nghiệm: 5ml mẫu nước, 3ml dung dịch K2Cr2O7 0,1N và 7ml H2SO4. Lưu ý phản ứng xảy ra mạnh nên cần cho acid cẩn thận, chảy dọc theo ống nghiệm. Sau đó, lắc mẫu thật đều.
- Làm tương tự 2 mẫu trắng (thay mẫu bằng nước cất).
- Cho ống nghiệm vào tủ sấy, nung ở nhiệt độ 150oC trong vòng 2 giờ
(nung kèm theo 1 ống mẫu trắng ở nhiệt độ 150oC).
- Sau thời gian phản ứng 2 giờ lấy ống nghiệm ra để nguội đến nhiệt độ
phòng, chuyển toàn bộ dung dịch qua erlen và tráng kỹống nghiệm bằng nước cất và gọp nước cất vào erlen.
GVHD: Nguyễn Hữu Thanh
- Thêm 2 -3 giọt chỉ thị ferroin và định phân bằng dung dịch FAS 0,01N. Kết thúc phản ứng khi dung dịch chuyển từ xanh lục sang màu nâu đỏ thì dừng lại và ghi kết quả thể tích dung dịch FAS đã dùng. Tương tự, định phân mẫu trắng đun và không đun. Công thức tính nồng độ của COD: COD(mg/l) = ( o 1) N 8 1000 m V V C V − × × × Trong đó:
Vođ: thể tích dung dịch FAS dùng chuẩn độ mẫu trắng, không đun (ml).
Vo: thể tích dung dịch FAS dùng chuẩn độ mẫu trắng, có đun (ml).
V1: thể tích dung dịch FAS dùng chuẩn độ mẫu nước cần phân tích (ml).
CN: nồng độ đương lượng của FAS; N = 3x 0,1/ Vođ 8: Đương lượng gam của oxy.
1000: hệ số chuyển đổi thể tích từ mililit sang lít.
Vm: thể tích mẫu đã được sử dụng (ml).
e. Phương pháp xác định NH4+
Xác định NH4+bằng phương pháp indophenol blue. * Thuốc thử
Dung dịch PRE 1: nước cất không đạm
Dung dịch PRE 2: phenole stock solution: hoà tan 312,5g phenol trong methanol thành 500ml.
Dung dịch PRE 3: sodium hypochlorite (NaClO) 5%.
Dung dịch PRE 4: dung dịch NaOH 67,5%: hòa tan 67,5g NaOH thành 100ml nước cất không đạm.
Dung dịch A: Hòa tan 150g Na3PO4.12H2O và 150g C6H5O7.2H2O trong 1000ml nước cất không đạm.
Dung dịch B: Hòa tan 75ml PRE 2 với 0,1g Na2[Fe(CN)5NO].2H2O trong 100ml nước cất không đạm.
Dung dịch C: Hòa tan 75ml PRE 3 với PRE 4 thành 100ml. * Tiến hành
GVHD: Nguyễn Hữu Thanh
Lần lượt đong 25ml mẫu nước cho vào bình tam giác 50ml. Sau đó, cho vào từng bình các dung dịch sau:
1ml thuốc thử A 1ml thuốc thử B 1ml thuốc thử C
Chờ 20 - 25 phút, xuất hiện màu xanh đem đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 630 ηm. Chú ý, nếu màu xanh quá đậm ta nên làm lại bằng cách pha loãng, sau khi ghi kết quả từ máy ta xử lý là với hệ số pha loãng sẽ cho kết quả
nồng độ của mẫu mà ta cần đo (Nguyễn Văn Phước và cộng tác viên, 2005).