3.2.1. Xác định sơ bộ thời gian đột biến
Chúng tôi tiến hành đột biến bằng cách đặt mẫu cần đột biến cách đèn UV có bước sóng 253,7 nm là 20 cm ở các thời gian khác nhau, sau đó dựa vào tế bào sống sót đánh giá khả năng sinh trưởng và khả năng chống chịu với tia tử ngoại của vi khuẩn, từ đó đưa ra thời gian đột biến phù hợp. Kết quả thể hiện ở bảng sau:
Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN 21
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thời gian tác động tia UV đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn A.xylinum BHN2.
Thời gian đột biến (phút) Khả năng mọc của vi khuẩn
3 + + + +
5 + + +
8 + +
10 +
15 -
Chú thích: + + + + : Mọc rất tốt (mật độ khuẩn lạc > 50 CFU/ đĩa petri) + + + : Mọc tốt (mật độ khuẩn từ 31 – 50 CFU/đĩa petri) + + : Mọc khá (mật độ khuẩn lạc từ 11- 30 CFU/đĩa petri) + : Mọc yếu (mật độ khuẩn lạc từ 1-10 CFU/đĩa petri) - : Không mọc trên 50% số đĩa petri.
Qua bảng số liệu ta thấy , thời gian tác động của tia UV càng dài thì càng ảnh hưởng càng mạnh tới khả năng sống sót của vi khuẩn. Ở thời gian 15 phút, không một tế bào nào của vi khuẩn sóng sót, tuy nhiên tác động tia UV dưới 8 phút thì chúng mọc tốt. Có thể giải thích điều này do sức sống của các tế bào vi khuẩn là khác nhau nên chúng chống chịu khác nhau đối với tia tử ngoại. Tại thời điểm 5 phút, khả năng sống sót của vi khuẩn lớn bởi vậy chúng tôi quyết định chọn thời gian 5 phút, với khoảng cách đèn tử ngoại 20 cm là thích hợp cho quá trình tác động tia UV đối với vi khuẩn A.xylinum
Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN 22
3.2.2. Xác định phương pháp đột biến phù hợp
Đột biến qua dịch: Nuôi vi khuẩn A.xylinum trong môi trường lỏng ở
25-300C trong 8-12h. Sau đó tiến hành đột biến dưới đèn UV.
Đột biến trên môi trường thạch đĩa: Nuôi vi khuẩn A.xylinum trên môi trường dịch thể ở 25-300C trong 8-12h. Pha loãng mẫu, trang đều trên môi trường thạch. Để trong tủ ấm ở 25-300C trong 2-3h để các tế bào phân chia. Sau đó tiến hành đột biến dưới đèn UV.
Qua hai cách đột biến nêu trên: Đột biến qua dịch và đột biến qua thạch đĩa, chúng tôi thấy rằng phương pháp đột biến trên thạch đĩa petri đơn giản, dễ tiến hành và thu được kết quả chính xác hơn.
Từ phương pháp đột biến phù hợp nêu trên chúng tôi có thể đưa ra sơ đồ đột biến như sau:
Hình 3.2. Sơ đồ đột biến phù hợp với vi khuẩn A.xylinum bằng tia UV
Nuôi trong môi trường dịch lỏng
Pha loãng, trang đều trên môi trường thạch đĩa 25 – 300C 2 – 3h Quan sát, tách riêng khuẩn lạc có hình thái đặc biệt. 25-300C.
Nhân thuần, hoạt hóa thử khả năng tạo màng 25 – 300C 8 – 12h Đột biến: Đèn UV λ= 253,7 nm, 5 phút, d = 20 cm
Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN 23
3.3. Tuyển chọn và kiểm tra khả năng tạo màng của các chủng sau đột biến
3.3.1. Đột biến và tuyển chọn
Dòng BHN2.3 được tiến hành đột biến theo phương pháp nêu trên chúng tôi thu được kết quả thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.3. Khả năng tạo màng của các chủng sau đột biến
STT Kí hiệu chủng Thời gian tạo màng Khả năng tạo màng
1 D1BHN2.3 - - 2 D2BHN2.3 - - 3 D3BHN2.3 3 – 4 ngày + 4 D4BHN2.3 - - 5 D5BHN2.3 - - 6 D6BHN2.3 2 – 3 ngày + 7 D7BHN2.3 2 – 3 ngày + 8 D8BHN2.3 - - 9 D9BHN2.3 - - Chú thích: + : Tạo màng - : Không tạo màng
Như vậy, qua đột biến chúng tôi thu được 9 chủng là: D1BHN2.3, D2BHN2.3, D3BHN2.3, D4BHN2.3, D5BHN2.3, D6BHN2.3, D7BHN2.3, D8BHN2.3, D9BHN2.3 (hình 3.3 và hình 3.4). Kiểm tra khả năng tạo màng
Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN 24
của 9 chủng thì thu được 3 chủng D3BHN2.3, D6BHN2.3, D7BHN2.3 có khả năng tạo màng các chủng còn lại mất hoạt tính không còn khả năng tạo màng.
Giải thích nguyên nhân các chủng sau đột biến mất khả năng tạo màng: Tia UV đã tác động vào bộ máy di truyền của vi khuẩn A.xylinum làm thay
đổi đoạn gen mã hóa khả năng tạo màng các chủng BHN2. Do vậy khi gen mã hóa tạo màng bị thay đổi sẽ dẫn tới mất khả năng tạo màng ở các chủng đột biến.
Hình 3.3. Khuẩn lạc sau đột biến của chủng D7BHN2.3
Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN 25
3.3.2. Kiểm tra khả năng tạo màng BC của các chủng sau đột biến
Nuôi cấy các chủng (D3BHN2.3, D6BHN2.3, D7BHN2.3) trên môi trường dịch thể, điều kiện môi trường nuôi cấy tĩnh, ở nhiệt độ phòng để kiểm tra khả năng tạo màng của 3 chủng. Kết được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.4. So sánh khả năng tạo màng của các chủng đột biến
STT Tên chủng Thời gian tạo màng Đặc điểm màng BC
1 D3BHN2.3 3 – 4 ngày Mỏng, đều và nhẵn
2 D6BHN2.3 2 – 3 ngày Mỏng, không đồng đều và
nhẵn
3 D7BHN2.3 2 – 3 ngày Mỏng, đồng đều và nhẵn.
Nhận xét: qua quan sát chúng tôi thấy rằng chủng D3BHN2.3 có thời gian tạo màng dài hơn so với 2 chủng còn lại; màng BC tạo ra mỏng, đều và nhẵn. Còn chủng D6BHN2.3 thì thời gian ngắn hơn so với chủng D3BHN2.3 nhưng màng tạo ra không đồng đều. Đối với chủng D7BHN2.3 có thời gian ngắn và màng BC mỏng, đồng đều và nhẵn. So với chủng gốc BHN2 ban đầu thì chủng đột biến D7BHN2.3 có khả năng tạo màng BC tốt hơn.
Hình 3.5. Khả năng tạo màng của chủng D7BHN2.3
D7BHN2.3 D7BHN2.3
Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN 26
Hình 3.6. Màng BC của chủng D7BHN2.3
3.4. Xác định sự biến đổi hình dạng tế bào, hình thái khuẩn lạc của chủng trước và sau đột biến.
Để xác định sự thay đổi hình dạng tế bào và hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn A.xylinum sau đột biến chúng tôi tiến hành nhuộm tế bào và quan sát. Kết quả thể hiện ở bảng 3.5, hình 3.7 và hình 3.8:
Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN 27
Bảng 3.5. Điểm sai khác giữa chủng ban đầu và chủng sau đột biến của
A.xylinum BHN2.
Điểm sai khác Trước đột biến
(BHN2)
Sau đột biến (D7BHN2.3) Thời gian quan
sát rõ khuẩn lạc 3 - 4 ngày 2 - 3 ngày Hình dạng Hình tròn, nhẵn hoặc xù xì. Mép bằng phẳng hoặc gợn sóng Hình tròn, nhẵn hoặc xù xì. Mép bằng phẳng hoặc gợn sóng
Màu sắc Trắng hoặc trắng sữa Trắng hoặc trắng sữa
Hình thái khuẩn lạc
Kích thước 1- 1,5 mm 0,5 – 1,2 mm
Hình dạng Hình que riêng lẻ hoặc
xếp thành chuỗi
Hình que riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi
Kích thước 1,5 – 2μm 1,5 – 2μm
Nhuộm Gram Bắt màu G - Bắt màu G -
Khả năng sinh bào tử Không Không Hình thái tế bào Khả năng di động Không Không
Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN 28
A. BHN2 B. D7BHN2.3
Hình 3.7. Hình thái tế bào của vi khuẩn A.xylinum BHN2 trước đột biến (A) và sau đột biến (B).
Hình 3.8. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn A.xylinum BHN2 trước đột biến (A) và sau đột biến (B)
Từ kết quả trên ta thấy: Hình thái tế bào và khuẩn lạc của chủng trước và sau đột biến có sự khác biệt không đáng kể. Chứng tỏ rằng: đột biến bằng tia UV không làm thay đổi hình dạng tế bào và hình thái khuẩn lạc. Quá trình đột biến không làm biến đổi chủng mà còn đưa lại một kết quả: Chủng đột biến khi kiểm tra khả năng tạo màng cho màng BC mỏng và độ đồng đều cao
Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN 29
hơn chủng BHN2 trước đột biến. Tuy nhiên chỉ quan sát về hình dạng tế bào và hình thái khuẩn lạc chưa đủ để khẳng định chủng A.xylinum BHN2 đã bị
đột biến dưới tác động của tia UV. Cần nghiên cứu và so sánh đặc điểm sinh lý, sinh hóa và đặc điểm sinh học phân tử của chủng đột biến và chủng gốc để có được những chỉ tiêu cụ thể về sự biến đổi này.
Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN 30
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
- Chúng tôi đã chọn được 5 chủng từ chủng A.xylinum BHN2 để kiểm tra khả năng tạo màng và chọn được chủng BHN2.3 làm chủng đầu dòng để đột biến dưới đèn UV.
- Đã xác định được thời gian đột biến thích hợp là 5 phút với khoảng cách là 20cm và cũng đã lựa chọn được phương pháp đột biến phù hợp là đột biến qua thạch đĩa petri với bước sóng 253,7nm.
- Qua đột biến đã tạo ra được 9 chủng trong đó có 3 chủng (D3BHN2.3, D6BHN2.3, D7BHN2.3) có khả năng tạo màng. Trong đó, chủng D7BHN2.3 có khả năng tạo màng tốt hơn chủng gốc BHN2.
- Hình dạng tế bào và hình thái khuẩn lạc của chủng BHN2 và chủng đột biến D7BHN2.3 có sự khác biệt không đáng kể.
2. Kiến nghị
- Do thời gian có hạn nên chúng tôi chỉ nghiên cứu được ảnh hưởng của tia UV tới khả năng sống sót của chủng A.xylinum BHN2 và chỉ gây đột biến lần đầu. Để có kết quả tốt hơn cần gây đột biến một số lần nữa.
- Cần nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng của môi trường tới khả năng tạo màng của các chủng đột biến.
- Cần xác định rõ về bản chất của việc đột biến bằng phương pháp phân tử.
- Cần nghiên cứu và so sánh các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đột biến và chủng gốc để có được chỉ tiêu cụ thể về sự biến đổi này.
Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998). Vi sinh vật
học. Nxb Giáo dục, tr.149-150.
2. Nguyễn Thành Đạt (1999). Cơ sở vi sinh vật học. Tập 1, Nxb Đại học Sư phạm Hà Nội, tr. 52-55, 62-102, 185-309.
3. Nguyễn Thành Đạt (2005). Cơ sở vi sinh vật học, tập 2, Nxb Đại học Sư phạm, tr. 7-9, 37-61, 169-171.
4. Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990). Thực
hành vi sinh vật. Nxb Giáo dục, tr. 17-34, 63-74, 89-92.
5. Vũ Thị Minh Đức (2001). Thực tập vi sinh vật. Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, tr. 1-50.
6. Nguyễn Thúy Hương (2006). Chọn lọc dùng Acetobacter xylinum thích hợp
cho các loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn. Luận án tiến sỹ khoa học sinh học, trường Đại học Quốc gia thành phố
Hồ Chí Minh.
7. Trương Thị Ngọc Hoa, Trương Nguyễn Quỳnh Hương (2005). Đa dạng hóa các môi trường sản xuất Natadecoco từ vi khuẩn Acetobacter xylinum. Số 2, Tạp chí khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp.
8. Phạm Thành Hổ (2006). Di truyền học, Nxb Giáo dục, tr. 238-258.
9. Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006). Nghiên cứu các đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng,
Tạp chí dược học, số 361.
10. Nguyễn Thị Mỹ Lan, Huỳnh Thị Phương Linh, Lê Thị Mỹ Phước, Nguyễn Quốc Hiển (2009). Bước đầu nghiên cứu hiệu ứng làm lành vết
Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN 32
thương của hỗn hợp Chitosan tan trong nước – Bacterial cellulose – Nano bạc.
Tạp chí Phát triển KH & CN, tập 12, số 09.
11. Chu Văn Mẫn (2003). Ứng dụng tin học trong sinh học. Nxb Đại học
Quốc gia Hà Nội.
12. Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh (2006). Di truyền học, tập 1, Nhà xuất bản Đại học Sư phạm, tr. 99-137.
13. Đinh Thị Kim Nhung (1996). Nghiên cứu một số đặc điểm của vi khuẩn
Acetobacter và ứng dụng lên men acetic theo phương pháp chìm. Luận án
PTS khoa học Sinh học Đại học Sư phạm Hà Nội.
14. Đinh Thị Kim Nhung, Trần Như Quỳnh, Nguyễn Thị Thuỳ Vân (2009). Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng bacterial celulose ứng
dụng trong điều trị bỏng. Báo cáo khoa học.
15. Đặng Hùng Thắng (1999). Thống kê và ứng dụng. Nxb Giáo dục, tr. 214- 267.
16. Nguyễn Thị Thùy Vân (2009). Nghiên cứu đặc tính sinh học và khả năng
tạo màng Bacterial cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum phân lập từ một số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam. Luận văn Thạc sỹ khoa học Sinh học,
trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
B. TÀI LIỆU TIẾNG ANH
17. Brown R.M., K.Zaar (1999). Cellulose structure and biosynthesis. Pure
Appl Chem. Vol, 71, pp. 765-775.
18. Canon, R.E., and Anderson, S.M. (1991). Biogenesis of Bacterial cellulose. Critical Reviews in Microbiology. Vol, 17, pp. 435-447.
19. Frateur J. (1950). Essai sur la systesmatique des Acetobacter. La cellule.
Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN 33
20. Forng E.r., Anderson S.M., Canon R.E. (1989). Synthetic medium for
Acetobacter xylinum that can be used for isolation of auxotrophic mutants and
study cellulose Biosynthesis. Applied and Enviromene microbiology, pp. 1317-1319.
21. Hong Joo Son, Moon Su Heo, Young Gyun Kim, Sang Joon Lee (2001). Optimization of fermentation conditions for the production of bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter sp. A9 in shaking cultures. Biotechnol Appl Bichem. Vol. 33, pp. 1-5.
22. Hong Joo Son, Hee Goo Kim, Keun Ki Kim, Han soo Kim, young Gyun Kim, Sang Joo Lee (2002). Inceased production of bacterial cellulose by
Acetobacter sp. V6 in synthetic media under shaking culture conditions. Bioresorse technology. Vol. 86, pp. 215-219.
23. Jonas, R. & Frarad, L.F. (1998). Production and application of microbial cellulose. Polymer Degradation and Stability. Vol. 59, pp. 101 – 106.
24. Kumiko Nanda, Kadere T.T, Kutima P.M, Njoroge M.S. (2008).
“Isolation and identification of the genera Acetobacter and gluconobacter in coconut toddy (mnazi)”. African Journal of biotechnology. Vol. 7, No. 16, pp. 2963-2971.
25. Trygve Brautaset, Rune Sandal, Espen Fjarvik, Svein Valla (1994).
Nucleotide sequence and epression analysis of Acetobacter xylinum
phosphoglucomutase gene. Microbilogy. Vol. 140, pp. 1183-1188.
26. Tomonori N., Naoto I., Teruko K., Yukiko K., Takayasu T., Fumihiro Y., Fukumi S., Takahis H. (1999) Enhancement of cellulose production by expression of sucrose synthase in Acetobacter xylinum. Applied Biological sciences. Vol. 96, pp. 14-18.
27. Wan, WK & Millon. E. (2005). Poly – bacterial cellulose nanocomposite. V. S. Pat. Appl. Publ US 2005037082 Al, 16.
Vũ Văn Khoan K33B Khoa Sinh – KTNN 34
28.http://www.cesti.gov.vn/kh-cn-trong-n-c/m-t-s-ng-d-ng-c-a-cellulose-vi- khu-n-bacterial-cellulose-bc-trong-l-nh-v-c-th-c-ph-m.html
29.http://www.dostbinhdinh.org.vn/MagazineNewsPage.asp?TinTS_ID=568 &TS_ID=51