Phổ khối lượng phun mự điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectra) được đo trờn mỏy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoỏ học, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
2.3.3. Phổ cộng hưởng từ nhõn (NMR)
Phổ cộng hưởng từ nhõn (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trờn mỏy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Húa học, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
2.3.4. Độ quay cực [α]D
Độ quay cực được đo trờn mỏy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện Hoỏ học – Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
2.4 Dụng cụ và thiết bị
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tỏch chiết
Cỏc dụng cụ và thiết bị dựng cho tỏch chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm: - Bỡnh chiết 30 lớt. - Micropipet. - Mỏy cụ quay chõn khụng. - Đốn tử ngoại 2 bước súng 254nm và 368 nm. - Tủ sấy chõn khụng.
- Mỏy sấy, bếp điện
- Bỡnh sắc ký loại phõn tớch và điều chế. - Cột sắc ký pha thường cỏc loại đường kớnh. - Cột sắc ký pha ngược trung ỏp.
- Mỏy phun dung dịch thuốc thử.
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xỏc định cấu trỳc.
- Mỏy phổ cộng hưởng từ hạt nhõn NMR AM500 FT-NMR spectrometer.
- Mỏy sắc ký lỏng cao ỏp ghộp nối phổ (ESI) AGILENT 1100 LC-MSD Trap
- Thiết bị đo điểm núng chảy Kofler micri-hotstage. - Thiết bị đo độ quay cực JASCO.
2.5 Hoỏ chất.
- Silica gel 60 (0,04-0,063mm) Merck.
- Silica gel pha đảo ODS hoặc YMS (30-50ỡm,Fujisilica Chemical Ltd.) - Bản mỏng trỏng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715).
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
- Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck).
- Cỏc loại dung mụi hữu cơ như methanol, etanol, ethyl acetate, chlorofrom, hexane, acetone... là loại hoỏ chất tinh khiết của Merck.
2.6. Nguyờn liệu thực vật
Cõy Vam (Diospyros dictyonema) đại mộc, nhỏnh non mảnh, khụng lụng. Lỏ cú phiến bầu dục, to 15- 20 x 6- 9 cm,khụng lụng, dày, dai, bỡa uốn xuống, gõn 10- 20 cặp, rừ, gõn tam cấp khụng thành mạng, hỡnh thang thưa, mặt trờn nõu, mặt dưới nõu đo đỏ, cuống 6- 8 mm. Chựm tụ tỏn ở nhỏnh to, dài 1,5- 2 cm; cọng hoa ngắn; hoa đen lỳc khụ; lỏ đài hỡnh tim cao 4- 5 mm, ống vành 7 mm, tai cao 3mm.
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
CHƯƠNG 3:
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Chiết phõn đoạn và phõn lập cỏc hợp chất
3.1.1. Thu mẫu thực vật và xử lý mẫu
- Thu thập lỏ cõy Vam và tiến hành phơi khụ;
- Lỏ sau khi được phơi khụ tiến hành cắt nhỏ và xay thành bột mịn; - Chuẩn bị bỡnh chiết (20 L) đõy là thiết bị thủy tinh với một cỏi khoỏ ở dưới đỏy để tạo tốc độ chảy cho quỏ trỡnh tỏch rửa dung mụi. Dung mụi cú thể núng hoặc lạnh. Cho vào bỡnh một lớp vải mịn để trỏnh bột làm tắc rỳt dịch chiết;
- Bột mịn lỏ Vam được cho vào bỡnh chiết (20 L).
- Tiến hành chiết mẫu bằng phương phỏp chiết ngõm. Do chiết ngõm là một trong những phương phỏp được sử dụng rộng rói nhất trong quỏ trỡnh chiết thực vật bởi nú khụng đũi hỏi nhiều cụng sức và thời gian.
- Dung mụi sử dụng chiết là dung mụi MeOH, ngõm chiết trong metanol (3 lần, 2 ngày/lần).
- Dung mụi sử dụng chiết phõn đoạn là dung mụi n-hexan, cloroform và ethyl axetate.
3.1.2.Phõn lập cỏc hợp chất
Dịch chiết metanol được cất loại dung mụi dưới ỏp suất giảm thu được 70 g dịch cụ. Dịch cụ này được phõn bố vào nước rồi chiết lần lượt với n- hexan, cloroform, etyl axetat và Butanol. Sơ đồ phõn lập như sau:
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
Sơ đồ 3.1.2.1. Sơ đồ chiết phõn đoạn dịch chiết metanol của cõy Vam
Sau khi cất loại dung mụi dưới ỏp suất giảm thu được cỏc cặn chiết n- hexan (15,0 g), cloroform (25,0 g), etyl axetat (12,0 g) và n-butanol (8,0 g). Tiến hành phõn lập chất bằng sắc ký cột:
- Lựa chọn cột tỏch phự hợp với lượng dịch đưa lờn cột, thụng thường tỷ lệ đường kớnh cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng và thể hiện khả năng tỏch của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yờu cầu tỏch, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Bổ sung n-BuOH Cặn n-Hexan (5 g) Bổ sung EtOAc Bột lỏ khụ ( 2 kg ) Chiết MeOH
Cặn MeOH (120g) Bổ sung nước
n-Hexan: nước 1/1 Cặn CHCl3 (10 g) CHCl3: nước 1/1 Cặn EtOAc (20 g) EtOAc: nước 1/1 Cặn n-BuOH (65 g) Lớp nước n-BuOH: nước 1/1 Bổ sung CHCl3 Lớp nước lớp nước Lớp nước
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
- Sử dụng sắc ký lớp mỏng để xỏc định giỏ trị Rf, với mỗi một chất sẽ cú một Rf khỏc nhau. Chớnh nhờ vào sự khỏc nhau về Rf mà người ta tỏch được từng chất ra khỏi hỗn hợp chất. Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yờu cầu tỏch. Nếu tỏch thụ thỡ tỷ lệ này thấp (dao động từ 1/5 đến 1/10), cũn nếu tỏch tinh thỡ yờu cầu tỷ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tỏch (tức là tuỳ thuộc vào sự khỏc nhau về Rf của cỏc chất) mà hệ số này dao động trong khoảng 1/20 đến 1/30
- Từ phõn đoạn cloroform tiến hành đưa chất lờn cột: Tẩm chất vào silica gel rồi làm khụ, tơi hoàn toàn rồi đưa lờn cột. Trong bước đầu phõn lập này việc tiến hành nhồi cột được thực hiện theo cỏch nhồi cột khụ. Theo cỏch này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi cũn khụ, sau đú dựng que mềm để gừ nhẹ lờn thành cột để cho chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đú cho chất đó tẩm silicagel lờn trờn và dựng dung mụi với độ phõn cực tăng dần chạy cột để chạy qua cột để tiến hành phõn đoạn.
Sơ đồ 3.1.2.2. Chiết phõn đoạn cloroform của cõy Vam
Sử dụng sắc ký lớp mỏng trong tỡm kiếm hoạt chất:
- Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trờn bản mỏng trỏng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phỏt hiện chất bằng đốn tử ngoại ở hai bước súng 254 nm và 368 nm hoặc dựng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lờn bản mỏng, sấy khụ rồi hơ núng trờn bếp
Cặn chiết CHCl3
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
- Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trờn bản mỏng trỏng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phỏt hiện vệt chất bằng đốn tử ngoại hai bước súng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rỡa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ núng để phỏt hiện vệt chất, ghộp lại bản mỏng như cũ để xỏc định vựng chất, sau đú cạo lớp Silica gel cú chất, giải hấp phụ bằng dung mụi thớch hợp
Đó tiến hành khảo sỏt cỏc hệ dung mụi như sau cho sắc ký lớp mỏng: - CHCl3:MeOH,
- CHCl3: axeton - MeOH: nước - n-hexane: axeton
tiến hành chạy sắc ký bản mỏng với cỏc tỷ lệ dung mụi khỏc nhau để tỡm được giỏ trị Rf tối ưu nhất.
Từ 10 g cặn chiết CHCl3 tiến hành phõn lập bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel và hệ dung mụi rửa giải là clorofoc/metanol tăng dần độ phõn cực theo tỉ lệ clorofoc/metanol từ 100/1 đến 100/100 (theo thể tớch) thu được 5 phõn đoạn kớ hiệu là BKE1-BKE5. Sau khi cất loại dung mụi dưới ỏp suất giảm thu được cỏc cặn tương ứng là BKE1 (1,5 g), BKE2 (5,0 g), BKE3 (4,5 g), BKE4 (5,5 g) và BKE5 (3,5 g).
Phõn đoạn BKE3 (4,5 g) được phõn lập trờn sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel và hệ dung mụi rửa giải là clorofoc/etyl axetat (4/1, v/v) thu được hợp chất 1 (15 mg) và hợp chất 2 (10 mg).
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
Sơ đồ 3.1.2.3. Sơ đồ phõn lập cỏc hợp chất 1 và 2 từ cõy Vam
3.2. Hằng số vật lý và cỏc dữ kiện phổ của cỏc hợp chất
3.2.1. Hợp chất 1: 5,11-Epoxy-3,9-megastigmanediol
Chất rắn khụng màu, nhiệt độ núng chảy 178 – 180oC.
25 D α : +21o (c=1.0, MeOH); ESI-MS: m/z 229 [M+H]+, 251 [M+Na]+, 211 [M-H2O + H]+, C13H24O3, M = 228. 1 H-NMR (500 Hz, CD3OD) (ppm): 1,65 (m, Ha-2), 1,57 (m, Hb-2), 3,97 (m, H-3), 1,49 (m), 1,81 (dd, J = 7,0, 13,5 Hz, H-4), 1,37 (H-6), 1,72 (m, Ha-7), 1,38 (m, Hb-7), 1,49 (m, H-8), 3,75 (m, H-9), 1,20 (d, J = 6,5 Hz, H-10), 3,44 (dd, J = 2,5, 8,0 Hz, Ha-11), 3,64 (d, J = 8,0 Hz, Hb-11), 1,02 (s, H-12) và 1,25 (s, H-13). 13 C-NMR (125 Hz, CD3OD) (ppm): 44,01 (C-1), 40,60 (C-2), 66,69 (C-3), 42,34 (C-4), 85,42 (C-5), 55,56 (C-6), 22,12 (C-7), 40,05 (C- 8), 68,78 (C-9), 23,46 (C-10), 78,24 (C-11), 21,81 (C-12) và 25,70 (C-13). Cặn CHCl3 - sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel; - clorofoc/metanol (100/1-
BKE1 BKE2 BKE3 BKE4 BKE5
1, 2
- Sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel - clorofoc/etyl axetat (4/1, v/v)
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp Chất bột vụ định hỡnh màu trắng, []D25 + 30 (c, 0,5 MeOH). 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) (ppm): 1,86 (br d, J = 12,0 Hz, Ha-2), 1,52 (m, Hb-2), 4,07 (m, H-3), 3,45 (dd, J = 16,0, 5,0 Hz, Ha-4), 2,02 (d, J = 16,0, Hz, Hb-4), 2,14 (dt, J = 12,5, 5,0 Hz, Ha-7), 2,05 (d, J = 12,5 Hz, Hb-7), 1,49 (m, H-8), 3,72 (m, H-9), 1,19 (d, J = 6,5 Hz,H-10), 1,06 (s, H-11), 1,09 (s, H-12), 1,66 (s, H-13), 4,44 (d, J = 7,5Hz, H-1'), 3,17 (dd, J = 7,5, 8,5 Hz, H-2'), 3,39 (t, J = 8,5Hz, H-3'), 3,32 (t, J = 8,5 Hz, H-4'), 3,30 (m, H-5'), 3,87 dd, J = 13,0, 2,5 Hz, Ha-6'), 3,67 dd, J = 13,0, 5,5 Hz, Hb-6'). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) (ppm): 38,78 (C-1), 47,50 (C-2), 73,26 (C-3), 39,77 (C-4), 125,10 (C-5), 138,54 (C-6), 25,54 (C-7), 40,67 (C-8), 69,17 (C-9), 23,24 (C-10), 28,81 (C-11), 30,26 (C-12), 20,01 (C-13), Glc: 102,33 (C-1'), 75,19 (C-2'), 78,14 (C-3'), 71,68 (C-4'), 77,88 (C-5'), 62,75 (C-6').
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ
4.1. Xỏc định cấu trỳc húa học của hợp chất 1 ( DH4A )
Hợp chất 1 (DH4A) thu được dưới dạng chất rắn khụng màu cú nhiệt độ núng chảy 178 – 180oC. Phổ 13C-NMR của hợp chất này xuất hiện tớn hiệu của 13 nguyờn tử cacbon, trong đú cú 3 nhúm CH3 tại C 23,46 (C-10), 21,81 (C-12) và 25,70 (C-13); hai nhúm CH nối với nguyờn tử ụxi tại C 66,69 và 68,78, một nhúm CH2 nối với nguyờn tử ụxi tại C 78,24; hai cacbon khụng nối với nguyờn tử hidro nào được xỏc định tại C 44,01 và 85,42, trong đú giỏ trị tại 85,42 cho thấy nguyờn tử cacbon này phải được nối với nguyờn tử ụxi; ngoài ra cũn cú một cacbon CH tại 55,56 và bốn nhúm CH2 khỏc cộng hưởng ở vựng trường khỏ cao tại 42,34, 40,60, 40,05 và 22,12. Tất cả cỏc cacbon này được xỏc định nhờ phổ DEPT 90 và DEPT 135. Trờn phổ 1H- NMR, ba nhúm metyl trong đú cú hai tớn hiệu singlet tại H 1,25 và 1,02 và một tớn hiệu doublet tại 1,20 (J = 6,5 Hz). Cỏc tớn hiệu cộng hưởng proton tương ứng với cỏc nguyờn tử cacbon tương ứng được xỏc định thụng qua phổ HSQC và phổ 1H-NMR. Hai tớn hiệu proton tại H 3,75, 3,97 cú tương tỏc HSQC với cacbon tương ứng tại C 68,78 và 66,69, hai tớn hiệu proton tại H
3,44 và 3,64 đều cú tương tỏc với một cacbon duy nhất tại C 78,24, phự hợp với kết quả trờn phổ DEPT, cỏc tớn hiệu proton khỏc của 4 nhúm metylen cũng được xỏc định và dẫn ra trờn bảng 1. Cỏc hợp chất cú 13 nguyờn tử cacbon phổ biến là cú khung megastigman, do đú điều gợi ý đầu tiờn với cỏc dữ kiện phổ nờu trờn là hợp chất DH4A cú khung megastigman.
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
Hỡnh 4.1.b. Phổ 13C-NMR của hợp chất 1
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp Bảng 4.1. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất 1 C δC#, a δCa,b δH (J = Hz)a,c HMBC (HC) 1 44,0 44,01 - 2 40,6 40,60 1,65 m/ 1,57 m 1, 3, 5, 11 3 66,7 66,69 3,97 m 1, 5 4 42,3 42,34 1,49 m/ 1,81 dd (7,0, 13,5) 1, 3, 5, 13 5 85,4 85,42 - 6 55,5 55,56 1,37* 7 22,1 22,12 1,72 m/ 1,38 m 8 40,0 40,05 1,49 m 9 68,8 68,78 3,75 m 10 10 23,5 23,46 1,20 d (6,5) 8, 9 11 78,2 78,24 3,44 dd (2,5, 8,0) 3,64 d (8,0) 1, 5, 6 1, 5, 6 12 21,8 21,81 1,02 s 1, 2, 6, 11 13 25,7 25,70 1,25 s 3, 5, 6
#C của 5,11-Epoxy-3,9-megastigmanediol [11], aĐo trong CD3OD,
b
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
Cỏc hợp chất cú khung megastigman cơ bản thường cú 4 nhúm metyl, trong đú cú hai nhúm metyl tại C-1 tạo thành cacbon bậc bốn tại đõy (điều này cũng phự hợp với giỏ trị cacbon bậc bốn tại 44,01), một nhúm metyl tại C-5 và mạch nhỏnh của khung gồm cú 4 nguyờn tử cacbon với nhúm metyl ở cuối mạch nhỏnh. Từ cỏc tương tỏc HMBC giữ proton H-10 với C-9, cựng với tớn hiệu doublet tại 1,20 của nhúm metyl cho thấy nhúm hydroxy phải được nối vào C-9, tương tỏc của H-13 ( 1,02) với cacbon C-1 ( 44,01)/ C-2 (40,60)/ C-6 ( 55,56) và đặc biệt với C-11 ( 78,24, CH2) khụng những khẳng định cỏc giỏ trị độ dịch chuyển húa học tại cỏc vị trớ nờu trờn mà cũn cho thấy nhúm metyl C-11 đó được hydroxyl húa. Chỳ ý đến tương tỏc HMBC khỏ rừ giữa H-11 với C-5 ( 85,42) cho thấy rừ ràng đó cú sự đúng vũng qua cầu ụxi giữa C-11 và C-5. Cỏc tương tỏc HMBC khỏc cũng được xỏc định và nờu ra trờn hỡnh vẽ. Nhúm hydroxyl khỏc được khẳng định là nối vào C-3 do cú tương tỏc HMBC giữa H-2 và H-4 với C-3 mà khụng cú tương tỏc của bất kỳ nhúm metyl nào với C-3. Ngoài ra, phổ 1H-1H COSY cũn xuất hiện tương tỏc giữa H-2 và H-3, giữa H-3 và H-4, giữa H-6 với H-7, H-7 với H-8, H-8 với H-9 và H-9 với H-10. Kết quả nờu trờn cho thấy hợp chất DH4A chớnh là 5,11-epoxy-3,9-megastigmanediol với cụng thức phõn tử dự đoỏn là C13H24O3 (M = 228). Kết quả phổ khối lượng xuất hiện pớc ion tại m/z 229 [M + H]+, 251 [M + Na]+, 211 [M - H2O + H]+ hoàn toàn phự hợp với cụng thức phõn tử nờu trờn. Cỏc dữ kiện phổ của DH4A được so sỏnh với cỏc dữ kiện đó cụng bố cho hợp chất 5,11-epoxy-3,9-megastigmanediol [11] (Bảng 4.1) và cho kết quả phự hợp hoàn toàn. Sự trựng khớp cao về cỏc giỏ trị phổ NMR và độ quay cực giữa hai hợp chất này cho phộp khằng định hợp chất DH4A là 5,11-epoxy-3,9-megastigmanediol. Hợp chất này là sản phẩm thủy phõn degluco của hợp chất ascleposide D (Hợp chất ascleposide D cú nhúm đường
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
Đõy là lần đầu tiờn hợp chõt 5,11-epoxy-3,9-megastigmanediol được tỡm thấy trong thiờn nhiờn và là hợp chất thiờn nhiờn mới.
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp O HO CH3 CH3 CH3 OH H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Hỡnh 4.1.g. Cấu trỳc húa học của hợp chất 1
O HO CH3 CH3 CH3 OH H-H COSY HMBC
Hỡnh 4.1.h. Cỏc tương tỏc HMBC và H-H COSY chủ yếu của hợp chất 1
4.2. Xỏc định cấu trỳc húa học của hợp chất 2
Hợp chất 2 thu được dưới dạng chất rắn vụ định hỡnh khụng màu. Phổ 13C-NMR của 2 xuất hiện tớn hiệu của 19 nguyờn tử cacbon tại 38,78 (C-1), 47,50 (C-2), 73,26 (C-3), 39,77 (C-4), 125,10 (C-5), 138,54 (C-6), 25,54 (C- 7), 40,67 (C-8), 69,17 (C-9), 23,24 (C-10), 28,81 (C-11), 30,26 (C-12), 20,01 (C-13), Glc: 102,33 (C-1'), 75,19 (C-2'), 78,14 (C-3'), 71,68 (C-4'), 77,88 (C- 5'), 62,75 (C-6'). Trong đú, 6 tớn hiệu cacbon thuộc vào một gốc đường glucose, 13 tớn hiệu cũn lại thuộc vào khung stigman, một khung cú 13 cacbon điển hỡnh. Phõn tớch cỏc phổ DEPT cho thấy hợp chất này ngoài 6 tớn
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
138,54 (C-6), hai cacbon CH phải nối với nguyờn tử oxi tại 73,26 (C-3), 69,17 (C-9), bốn tớn hiệu CH3 tại 23,24 (C-10), 28,81 (C-11), 30,26 (C-12), 20,01 (C-13). Tớn hiệu cacbon bậc 4 cộng hưởng tại 38,78 (C-1) điển hỡnh cho sự cú mặt của 2 nhúm metyl cựng gắn vào C-1. Đối với khung megastigman, nối đụi thường xuất hiện tại C-5/C-6, cỏc nhúm hydroxyl thường xuất hiện tại C-3 và C-9. Như vậy với cỏc dữ kiện phổ nờu trờn cú thể dự đoỏn được cấu trỳc khung megastigman của 2 như hỡnh …
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp