Nếu chúng ta muốn áp dụng phương pháp microsatellite để nghiên cứu di truyền ở một loài nào đó thì trước tiên hãy thử áp dụng phân tích với primer microsatellite của những loài có quan hệ di truyền gần gũi với loài đó. Trong trường hợp không tìm được primer microsatellite của những loài thân thuộc, chúng ta có thể tự thiết kế primer microsatellite, bằng các bước sau:
1- Ly trích để thu DNA tổng số.
2- Phân cắt toàn bộ genome thành những đoạn DNA có kích thước trung bình từ 300-600bp bằng enzyme cắt giới hạn.
3- Chèn những đoạn DNA được cắt ở trên vào plasmid để tạo nhiều bản sao DNA, loại plasmid thường được sử dụng ở đây là PUC19 vì vị trí cắt của plasmid này đã được xác định rõ.
4- Chuyển các plasmid lên màng nylon.
5- Dùng các probe để lai với màng, probe là những oligonucleotide chứa trình tự microsatellite quan tâm (VD: (AC)10), và đã được đánh dấu phóng xạ hoặc huỳnh quang.
6- Phát hiện và nuôi cấy những dòng vi khuẩn chứa plasmid cho kết quả dương tính khi lai với probe.
7- Dùng enzyme cắt giới hạn để thu lại các đoạn DNA được chèn trong plasmid, tiến hành phân tích các đoạn DNA này trên agarose gel 1%.
8- Dùng phương pháp lai Southern với các probe như trên để phát hiện lại một lần nữa các đoạn DNA chứa trình tự microsatellite quan tâm.
9- Đem giải trình tự và xác định microsatellite cũng như trình tự vùng flanking nằm ở 2 bên trình tự microsatellite, đây là vùng để thiết kế primer.
10- Chọn ra những trình tự microsatellite phù hợp nhất để thiết kế primer (thông thường phải có ít nhất 8 lần lặp lại) tùy theo mục đích nghiên cứu.
11- Tổng hợp cặp primer đặc hiệu cho từng locus, thông thường từ 20-30 bp nằm trong vùng flanking và không được nằm ngay sát với trình tự microsatellite. Primer forward được đánh dấu huỳnh quang, và màu huỳnh quang của sản phẩm khuếch đại bởi primer sẽ được phát hiện bằng tia laser khi đưa vào phân tích trình tự.