f) Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:
2.2.3Máy đo quang phổ UV − VIS
2.2.3.1 Cấu tạo và nguyên tắc
Hình 2.8: Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ hai chùm tia
Nguyên tắc: Phổ hấp thụ UV − VIS là phổ hấp thụ của chất phân tích ở trạng thái dung dịch đồng thể với một trong các dung môi như nước, metanol, benzen, aceton, CCl4,… Các bước đo thực hiện như sau:
Hòa tan chất phân tích trong 1 dung môi phù hợp nếu chất đó có phổ hấp thụ nhạy trong vùng tử ngoại, khả kiến. Thường là kim loại, tác dụng với thuốc thử trong dung môi thích hợp để tạo ra hợp chất có phổ hấp thụ UV − VIS nhạy.
Chiếu vào dung dịch mẫu chứa hợp chất cần phân tích 1 chùm sáng có bước sóng phù hợp để chất phân tích hay sản phẩm của nó hấp thu bức xạ tạo ra phổ hấp thu UV − VIS của nó. Vì thế chất phân tích cùng dung môi cần được chứa trong ống đo cuvet có chiều dày xác định.
Thu, phân ly phổ và chọn bước sóng cần đo ghi lại giá trị mật độ quang A của phổ, nghĩa là đo cường độ chùm sáng sau khi đi qua dung dịch mẫu phân tích [7-10].
Huỳnh Minh Tính MSSV: 2102306 15
2.2.3.2 Nguồn sáng
Nguồn sáng máy quang phổ là chùm bức xạ phát ra từ đèn. Máy quang phổ dùng đèn hydro hay đèn deuterium cho phổ phát xạ liên tục trong vùng UV từ 380 – 160 nm (nhưng thường sử dụng 340 – 200 nm) và đèn vonfram halogen đo vùng từ 2500 – 380 nm. Một yêu cầu đối với nguồn sáng là phải ổn định, tuổi thọ cao và phát bức xạ liên tục trong vùng phổ cần đo.
Đèn Deuterium: Cấu tạo gồm 1 sợi đốt phủ oxit và 1 cực kim loại đặt trong 1 bóng thuỷ tinh chứa khí deuteri hoặc hydro, có cửa sổ bằng thạch anh để bức xạ tử ngoại đi ra vì các bức xạ này không truyền qua được thủy tinh. Khi sợi đốt được đốt nóng, electron sinh ra kích thích các phân tử khí deuteri (hoặc hydro) biến thành nguyên tử và phát ra photon theo phản ứng:
D2 + Ee => D2* + D’’ + hv Ee = ED2* = ED’ + ED’’ + hv
Đèn vonfram halogen: Nguồn sáng phổ biến nhất để tạo ra bức xạ khả kiến và cận hồng ngoại là đèn dây tóc vonfram (W) từ 2500 – 380 nm. Đèn vonfram halogen chứa một lượng nhỏ iot trong vỏ bọc bằng thủy tinh thạch anh chứa dây tóc W, có thể hoạt động ở nhiệt độ khoảng 3500 o
K. Điều này cho phép đèn làm việc với cường độ cao hơn và mở rộng khoảng bước sóng phát ra vào một phần vùng tử ngoại. Đèn loại này cũng có tuổi thọ cao hơn do giảm sự bay hơi của W khi hoạt động. Các hơi W sẽ tác dụng tạo WI2 khuếch tán quay lại dây tóc ở đó nó phân hủy tạo lại W.
2.2.3.3 Bộ đơn sắc
Bộ đơn sắc có chức năng tách bức xạ đa sắc thành bức xạ đơn sắc, bao gồm: Kính lọc, lăng kính hay cách tử. Với những máy đơn giản các bộ kính lọc màu cho một vùng phổ nhất định hoặc dùng lăng kính để tách các chùm tia đơn sắc.
Trong các máy có độ phân giải cao và có độ nhạy cao, các bộ đơn sắc hóa là các bộ cách tử phản xạ. Cách tử là một bảng nhôm hay các kim loại Cu, Ag, Au,... được vạch thành những rãnh hình tam giác song song. Khi chiếu ánh sáng qua cách tử, phần còn lại có tác dụng tạo nên vân nhiễu xạ có bước sóng khác nhau, khi quay cách tử sẽ tạo ra phổ nhiễu xạ giống như trường hợp ánh sáng qua lăng kính. Ưu điểm khi sử dụng cách tử sẽ cho độ phân giải tốt, tán sắc tuyến
Huỳnh Minh Tính MSSV: 2102306 16
tính, độ rộng của dải ổn định, chọn bước sóng đơn giản, gọn nhẹ, dễ chế tạo nên hiện nay sử dụng cách tử tạo ánh sáng đơn sắc được ưa chuộng. Cách tử dùng cho UV – VIS có 1200 vạch/mm (thường dao động từ 300 – 3600 vạch/mm), số vạch càng nhiều năng suất phân giải càng cao.
2.2.3.4 Detector
Detector là bộ phận thu nhận chùm sáng và chuyển chúng thành tín hiệu điện để đo cường độ của chùm sáng đó. Trong các máy đơn giản sử dụng tế bào quang điện, trong các máy hiện đại có độ nhạy cao thường dùng các ống nhân quang điện.
Cấu tạo của cả hai loại này tương tự nhau nhưng electron phát ra từ catot trong ống nhân quang điện được gia tốc hướng về một dynode và được duy trì một thế cao hơn 90 V so với catot. Electron này khi đập vào bề mặt của dynode thì tạo ra những electron thứ cấp và sau đó được gia tốc để hướng về dynode thứ hai có thế dương hơn 90 V so với dynode thứ nhất. Một lần nữa sự khuếch đại số electron xảy ra và khi qua hàng loạt dynode liên tiếp số electron tạo thành tăng lên đến 106 đến 107 cho mỗi photon đập vào catot. Như vậy dòng điện được khuếch đại và được đo.
Huỳnh Minh Tính MSSV: 2102306 17
2.2.3.5 Cuvet
Sử dụng cuvet thạch anh đo được bước sóng từ 190 – 1100 nm.
Hình 2.10: Cuvet thạch anh 1cm và khe đặt cuvet trong máyquang phổ UV - VIS
2.2.3.6 Thông số kỹ thuật phần cứng
Các thông số kỹ thuật phần cứng máy quang phổ được thiết lập như sau: Hệ quang học 2 chùm tia.
Detector: Silicone photodiode.
Bộ giữ cuvet thích hợp nhiều loại cuvet khác nhau. Thang bước sóng: 1100 – 190 nm
Độ rộng khe (băng thông): 1,5 nm Độ chính xác bước sóng: ± 0,3 nm Độ lặp lại bước sóng: ± 0,1 nm Ánh sáng lạc (stray light): <0,05% Tốc độ quét sóng: max 3600 nm/phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thang đo hấp thu: từ - 3.0000 đến + 3.0000 ABS Độ phân giải hấp thu: 0,0001 ABS
Độ chính xác trắc quang: ± 0,001 ABS (0 – 0,5 ABS) ± 0,004 ABS (0,5 – 1 ABS) ± 0,008 ABS (1 – 2 ABS) ± 0,3% T Độ lặp lại trắc quang: ± 0,001 ABS (0 – 0,5 ABS) ± 0,002 ABS (0,5 – 1 ABS) ± 0,004 ABS (1 – 2 ABS)
Huỳnh Minh Tính MSSV: 2102306 18
± 0,15% T
Độ trôi đường nền: 0,0003 ABS/giờ (tại 500 nm sau 2 giờ hoạt động). Độ ổn định đường nền: 0,0003 ABS
Độ phẳng đường nền: ± 0,002 ABS (từ 200 – 950 nm) Lưu và tự động hiệu chỉnh đường nền.
Thang đo nồng độ (concentration): 0 – 9999
Nguồn sáng: Deuterium (D2) và Halogen Tungsten (W) Có chức năng chuyển đèn (lamp Switchover).
Cổng giao tiếp: RS232, kết nối máy tính. Kích thước: 540 × 560 × 235 mm
Trọng lượng: 27 kg Nguồn điện: 220 V
2.2.3.7 Thông số kỹ thuật phần mềm
Các chức năng đo trắc quang multi – wavelength (ABS, %T và Ratio). Quét phổ từ 1100 – 190 nm, tốc độ quét lên tới 3600 nm/phút (bước sóng 0,1 nm), dữ liệu được hiển thị dưới dạng đồ họa và có thể đặt chồng nhiều lớp phổ để so sánh và tính toán.
Quét theo thời gian và phân tích động học từ 30 – 9999 giây. Lập đường chuẩn lên tới 100 mẫu chuẩn và 3 bước sóng khác nhau. Ngoài ra cón có các chức năng phân tích DNA/RNA, protein,… Có thể xuất dữ liệu in dưới dạng excel. Tất cả các chức năng được điều khiển thông qua máy tính với các phần mềm chuyên dụng đi kèm.
Đề tài nghiên cứu được tiến hành trên máy quang phổ UV − VIS 2 chùm tia Model 6800 của công ty Jeway. Đây là phiên bản 2 chùm tia đầu tiên của công ty Jenway sản xuất với độ ổn định quang học cao, bề rộng khe phổ 1,5 nm đảm bảo độ phân giải tốt và cho kết quả đo lường chính xác. Cùng với phần miền Flight Deck 1.0 cung cấp cho người sử dụng những phương pháp quang phổ cơ bản như: Quét phổ, định lượng, đo DNA/RNA và protein, đo phổ đa bước sóng (6 bước sóng), đo phổ theo thời gian và động học. Kết quả phân tích được lưu cũng như được xuất sang tập tin excel một cách dễ dàng [7-10].
Huỳnh Minh Tính MSSV: 2102306 19
Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm
Phòng thí nghiệm Hóa phân tích, Bộ môn Hóa học, khoa Khoa Học Tự Nhiên, Trường Đại Học Cần Thơ. Khu II, Đường 3 − 2, phường Xuân Khánh, quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ.
3.1.2 Thời gian
Đề tài được thực hiện trong khoảng thời gian từ 9/2013 đến 11/2013.
3.1.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Máy lắc siêu âm.
Pipet: 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL. Bình định mức: 10 mL, 100 mL, 1000 mL. Cân phân tích có thể cân chính xác đến 0,0001 g. Máy quang phổ UV − VIS 6800.
Các dụng cụ thí nghiệm cần thiết khác.
Hóa chất: Metanol, nước cất, acetone, chất chuẩn Losartan potassium.
Hình 3. 1 Máy quang phổ UV – VIS 6800 và máy lắc siêu âm
3.2 Định tính 3.2.1 Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên nguyên tắc đo độ hấp thụ và cực đại hấp thụ của hoạt chất Losartan potassium trong dung dịch thử phải tương ứng với độ hấp thụ và cực đại hấp thụ của hoạt chất Losartan potassium trong dung dịch chuẩn.
Huỳnh Minh Tính MSSV: 2102306 20
3.2.2 Định tính dung dịch chuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lấy 120 mg chất chuẩn cho vào bình định mức 1000 mL và thêm vào đó metanol cho đến vạch định mức, lắc đều khoảng 15 phút, lọc, bỏ 10 mL đầu, phần dung dich lọc còn lại được dùng làm dung dịch gốc có nồng độ 120 ppm.
Lấy 83,3 mL dung dịch gốc cho vào bình định mức 100 mL, pha loãng với metanol cho đến vạch, lắc đều được dung dich chuẩn có nồng độ 100 ppm.
Lấy 1,2 mL từ dung dịch chuẩn cho vào bình định mức 10 mL, thêm metanol đến vạch định mức, lắc đều.
Tiến hành quét phổ ở bước sóng 400 – 190 nm, xác định bước sóng cực đại, dung dịch metanol làm mẫu trắng.
3.2.3 Định tính dung dịch thử
Tiến hành định tính 5 loại thuốc bán trên thị trường có chứa hàm lượng Losartan potassium sau:
Bảng3.1: Mẫu chứa Losartan potassium
Nhãn hiệu Công ty Hàm lượng
Losartan 50 mg Domesco
50 mg Combizar 50 mg United pharma
Losap 50 mg Baroque pharmaceuticals pvt.Ltd Resilo 50 mg Dr.Reddy’s lab
Losacar 50 mg Cidila healthcare
Cân chính xác 1 viên tương ứng khoảng 50 mg Losartan potassium cho vào bình định mức 100 mL, thêm metanol vào cho tới vạch định mức, lắc đều, lọc, loại bỏ 10 mL dung dịch lọc đầu. Lấy phần dịch lọc còn lại.
Lấy 0,1 mL dung dịch lọc trên cho vào bình định mức 10 mL, thêm metanol vào cho tới vạch định mức, lắc đều.
Quét phổ mẫu thử ở bước sóng từ 400 – 190 nm, xác định bước sóng cực đại, dung dịch metanol làm mẫu trắng.
Huỳnh Minh Tính MSSV: 2102306 21
3.3 Định lượng
3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính
Lấy 83,3 mL dung dịch gốc cho vào bình định mức 100 mL, pha loãng với metanol cho đến vạch định mức, lắc đều, làm dung dịch chuẩn. Tiến hành pha dãy dung dịch như bảng sau, định mức trong bình 10 mL.
Bảng3.3: Khảo sát khoảng tuyến tính
Bình Nồng độ (mg/L) Dung dịch chuẩn (mL) Định mức (mL) 1 0 0 10 2 5 0,5 3 10 1 4 15 1,5 5 20 2 6 25 2,5 7 30 3 8 35 3,5 9 40 4
Tiến hành đo độ hấp thụ quang của dãy tuyến tính ở bước sóng λ = 206 nm. Xác định phương trình hồi quy C = K1.ABS + K0 và hệ số tương quan tuyến tính (R) giữa nồng độ và độ hấp thụ quang.
3.3.2 Xây dựng đường chuẩn
Lấy chính xác dung dich chuẩn được pha ở phần trên, định mức trong bình 10 mL, có nồng độ như bảng sau:
Bảng3.2: Xây dựng đường chuẩn
Bình Nồng độ mg/L Dung dịch chuẩn (mL) Định mức (mL) 1 0 0 10 2 2 0,2 3 4 0,4 4 6 0,6 5 8 0,8 6 10 1 7 12 1,2
Tiến hành đo độ hấp thụ quang của dãy chuẩn ở bước sóng λmax. Xác định phương trình hồi quy C = aABS + b và hệ số tương quan tuyến tính (R) giữa nồng độ và độ hấp thụ quang. Dựa trên phương trình hồi quy đã lập được ta tiến hành định lượng 5 loại dược phẩm có chứa thành phần Losartan potassium [11-14].
Huỳnh Minh Tính MSSV: 2102306 22
3.3.3 Định lượng mẫu thử
Cân chính xác 1 viên tương ứng với 50 mg Losartan potassium đem nghiền mịn cho vào bình định mức 100 mL, thêm một ít metanol vào sau đó đặt vào bể siêu âm khoảng 15 phút. Lấy ra cho thêm metanol tới vạch định mức, lắc đều, lọc, bỏ 10 mL dung dịch lọc đầu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lấy 0,1 mL dung dịch vừa lọc cho vào bình định mức 10 mL, định mức với metanol tới vạch, lắc đều, đem đo ở bước sóng λmax , metanol làm mẫu trắng[11-14].
3.3.4 Khảo sát độ lặp lại
Cân chính xác 1 viên tương ứng với 50 mg Losartan potassium vào bình định mức 100 mL, thêm vào một ít metanol đem lắc siêu âm khoảng 15 phút, thêm metanol đến vạch định mức, lắc đều , lọc, bỏ 10mL dung dịch lọc đầu.
Lấy chính xác 0,1 mL dung dịch lọc cho vào bình định mức 10 mL, thêm metanol cho đến vạch định mức, lắc đều khoảng 15 phút sau đó đem đo ở bước sóng 206 nm, metanol làm mẫu trắng.
Bảng3.3: Khảo sát độ lặp lại
Bình 1 2 3 4 5 6
Dung dịch mẫu (mL) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
CH3OH Định mức tới vạch 10 mL
Làm tương tự như trên đối với 5 mẫu thuốc khảo sát.
3.3.5 Khảo sát độ đúng
Khảo sát độ đúng (tỉ lệ phục hồi) của chất chuẩn Losartan potassium khi cho vào mẫu thử, tỉ lệ phục hồi trung bình phải đạt 98% < Đ < 102%.
3.3.5.1 Chuẩn bị mẫu
Mẫu chuẩn: Lấy 83,3 mL dung dịch lọc gốc cho vào bình định mức 100 mL, pha loãng với metanol cho đến vạch định mức, lắc đều.
Mẫu thử: Cân chính xác 1 viên thuốc tương đương với 50 mg Losartan potassium nghiền mịn cho vào bình định mức 100 mL, thêm vào một ít metanol, đem lắc siêu âm cho Losartan potassium tan hết khoảng 15 phút, dùng metanol định mức tới vạch, lắc đều, lọc, bỏ 10 mL dung dịch lọc đầu [7-15].
Huỳnh Minh Tính MSSV: 2102306 23
3.3.5.2 Tiến hành
Lấy 0,1 mL dung dịch lọc của mẫu thử cho vào bình định mức 10 mL, thêm metanol cho tới vạch định mức, lắc đều.
Lấy 0,1 mL dung dịch mẫu thử vừa lọc và 0,2 mL dung dịch lọc mẫu chuẩn cho vào bình định mức 10 mL khác, thêm metanol cho tới vạch, lắc đều.
Đo độ hấp thụ của hai bình ở bước sóng 206 nm, metanol làm mẫu trắng. Bảng3.4: Khảo sát độ đúng
Bình Mẫu thử (mL) Mẩu chuẩn (mL) Dung dịch metanol
1 0,1 0 Định mức 10 mL
2 0,1 0,2 Định mức 10 mL
Huỳnh Minh Tính MSSV: 2102306 24
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Quét phổ và xác định bước sóng cực đại
Quét phổ Losartan potassium chuẩn với nồng độ C= 12 ppm trong khoảng bước sóng 400 190 nm. ABS nm Smooth: 10 Deri.: 0 200 250 300 350 400 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 Hình 4.1: Phổ xác định buớc sóng cực đại
Dựa vào phổ đồ trên nhận thấy có một đỉnh peak ở 206 nm. Vậy bước sóng cực đại λmax = 206 nm.
Huỳnh Minh Tính MSSV: 2102306 25 4.2 Định tính ABS nm Smooth: 125 Deri.: 0 200 250 300 350 400 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0
Hình 4.2: Chồng phổ mẫu chuẩn và 5 mẫu thử
Từ kết quả định tính bằng phương pháp UV VIS cho ta thấy 5 mẫu thuốc Losartan 50 mg, Combizar 50 mg, Losap 50 mg, Resilo 50 mg, Losacar 50 mg, đều có chứa Losartan potassium. Cực đại hấp thu ở λmax = 206 nm. Trên cơ sở đó ta có thể tiến hành định lượng Losartan potassium trong 5 mẫu dược phẩm trên.
Huỳnh Minh Tính MSSV: 2102306 26 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.3 Dãy tuyến tính
Hình 4.3: Khoảng tuân theo định luật
Hình 4.4: Đồ thị vượt khoảng tuyến tính
Dựa vào 2 đồ thị cho thấy khoảng tuyến tính của Losartan potassium nằm trong khoảng nồng độ từ 0 25 ppm, từ 30 ppm trở lên không còn tuyến tính.
Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 10 20 30 C ABS Series1 C = 12,5279.ABS – 0,0745
Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 20 40 60 C ABS Series1 C = 14,4953 – 1,8262
Huỳnh Minh Tính MSSV: 2102306 27
Xây dựng đường chuẩn
Bảng4.1: Nồng độ và ABS của đường chuẩn
Bình 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ ppm 0 2 4 6 8 10 12 ABS 0 0,1794 0,3591 0,5261 0,6979 0,8688 1,0477 ABS nm Smooth: 35 Deri.: 0 200 250 300 350 400